В этом протоколе подробно описаны шаги по использованию эмбрионов рыбок данио-рерио для экспериментов по радиационному скринингу, а также некоторые наблюдательные подходы для оценки лечения различными лекарственными препаратами и радиацией. Это поможет читателям установить полувысокопроизводительный скрининг лекарственных средств, включающий рентгеновское воздействие с использованием эмбрионов рыбок данио, что поможет оценить радиотоксичность и эффективность различных используемых препаратов. Эта процедура может быть использована для скрининга и валидации или оценки различных лекарств в качестве потенциальных радиосенсибилизаторов или протекторов, которые могут быть дополнительно изучены или использованы в области лучевой терапии рака или радиобиологии.
Для начала понаблюдайте за растущими эмбрионами под препарирующим микроскопом. Определите правильную стадию и удалите все мертвые или нездоровые эмбрионы. Обеспечьте адекватную стадию эмбриона, если дозы облучения и лекарства будут введены на определенной стадии гаструляции.
Перед началом эксперимента осторожно распределите здоровые эмбрионы по экспериментальным планшетам с помощью пипетки Пастера. Для каждой экспериментальной группы берут от 15 до 20 эмбрионов. При постановке радиационного эксперимента включите контрольную необлученную и только радиационную группу.
Распределите эмбрионы в планшете лунки, если радиационные экраны могут покрыть и защитить дополнительные лунки от радиации, в то время как другие лунки подвергаются воздействию определенной дозы облучения. В противном случае используйте отдельные пластины или диски, чтобы увидеть эмбрионы за одну дозу облучения. Включите рентгеновский облучатель и запустите инициализацию и прогрев аппарата.
Поместите экспериментальную пластину под облучатель внутри аппарата в центре, убедившись, что пластина находится непосредственно под источником рентгеновского излучения. А затем установить дозу и начать рентген. После завершения облучения выньте пластины, выключите программу аппарата, выключите аппарат и проверьте пластины под микроскопом сразу после облучения.
Удалите мертвые эмбрионы и запишите их количество, оценив их под препарирующим микроскопом. Верните тарелки в инкубатор при температуре 28,5 градусов по Цельсию. Собирайте данные через заранее определенные промежутки времени после проведения облучения.
Запишите все возможные наблюдения, такие как выживаемость, эффективность вылупления, стадия развития, количество сердцебиений, искривление тела и хвоста, отек перикарда, удлинение желточного мешка, микроцефалия, развитие плавательного пузыря, общая моторика или активность и т. д. Чтобы получить изображения, выберите репрезентативные эмбрионы на чистом слайде. Проверьте эмбрионы под микроскопом, сориентируйте их в определенном направлении.
Кривая выживаемости эмбрионов, облученных через шесть часов после оплодотворения, показала, что в контрольной группе и эмбрионах, подвергшихся воздействию 2 и 5 серых, не было выявлено значимой гибели эмбрионов. Количество ударов сердца в минуту показало, что частота сердечных сокращений значительно уменьшалась при увеличении доз рентгеновского излучения. В контрольной группе с каждым 24-часовым интервалом наблюдалось увеличение частоты сердечных сокращений.
Тяжелая сердечно-сосудистая деформация подозревается у эмбрионов, подвергшихся воздействию 15 и 20 грей радиации, поскольку сердцебиение значительно упало. Для эмбрионов, подвергшихся воздействию различных доз радиации в разные моменты времени, выявляются и оцениваются различные фенотипические дефекты и дефекты развития. Также были проведены морфологические наблюдения за искривлением позвоночника или хвоста, пороками развития головы и микроцефалией, дефектами развития, отеком перикарда, деформациями желточного мешка, деформациями плавательного пузыря и изменениями в структуре глаз Для протокола, который мы продемонстрировали, выбор здоровых эмбрионов, правильное размещение эмбрионов в облучателе и правильная оценка перекрестных аномалий являются ключом к этой процедуре.
