Этот метод позволяет визуализировать мозг рыбок данио на более поздних личиночных стадиях, чтобы позволить наблюдать нейронную архитектуру очень подробным образом in vivo, что ранее было невозможно. Пигментные клетки, которые появились во время более позднего развития личинок и мешают мозгу четкой визуализации, не являются проблемой с этим методом, потому что они просто удаляются. С помощью метода должна быть возможность изучения процессов, которые происходят на более поздних стадиях во время личинкового развития мозга, процессов, влияющих на синаптическую пластичность, дегенерацию нейронов или их регенерацию.
Перед началом эксперимента используйте съемник микропипетки для приготовления острых, тонких, стеклянных игл из стеклянных капилляров. Затем используйте пластиковую пипетку Пастера, чтобы собрать личинку в чашку Петри диаметром 90 миллиметров, содержащую соответствующий раствор. Переложите выбранную личинку на чашку Петри диаметром 35 миллиметров, содержащую ACSF, и поместите квадратную стеклянную крышку диаметром 24 на 24 миллиметра в крышку чашки Петри.
Затем аликвотирует объем ACSF, необходимый для эксперимента, в соответствующий флак для оксигенации карбогеном. Чтобы встроить личинку, используйте пипетку Пастера для переноса обезболенной личинки в монтажную камеру под стереомикроскопом. Если какая-либо личинка все еще способна двигаться, не используйте рыбу для эксперимента, пока рыба полностью не сможет двигаться.
Когда личинка неподвижна, осторожно удалите лишнюю среду и сразу же добавьте на личинку хотя бы один миллилитр низкоплавкой агарозы. Ориентируйте рыбок данио с дорсальной областью, обращенной вверх как можно ближе к поверхности агарозы. Если личинка будет изображена с помощью перевернутого микроскопа, после затвердевания обрежьте агарозу, содержащую личинку, в небольшой кубовидный блок.
Чтобы подвергнуть мозг визуализации, обрежьте избыточную агарозу над интересующей областью мозга по мере необходимости и используйте стеклянную иглу, чтобы сделать небольшой разрез через кожу вблизи, но не над интересующей областью, не проникая слишком глубоко в ткань. Едва перемещая иглу прямо под поверхностью кожи, продолжайте осторожно делать очень маленькие надрезы вокруг интересующей области, пока кожа над интересующей областью не может быть удалена или отодвинуна в сторону. Когда ткань была удалена из всех эмбрионов, добавьте небольшую каплю низкоплавкой агарозы в ранее подготовленную камеру визуализации инвертированного микроскопа и используйте небольшой шпатель, чтобы перевернуть кубовидный блок агарозы на 180 градусов на каплю агарозы в камере визуализации.
Когда агароза затвердеет, заполните камеру визуализации свежим ACSF и начните визуализацию личинки. Здесь может наблюдаться интактная 14-дневная трансгенная личинка после оплодотворения с еще неповрежденным черепом. Как показано, пигментные клетки внутри накладывающегося кожного отдела распределены по всей голове, мешая флуоресцентному сигналу в интересующей области.
После операции на открытом черепе интересующая область становится свободно доступной для детальной визуализации с высоким разрешением. Барьер кожи, черепа и или гематоэнцефалических барьеров также препятствует проникновению веществ в мозг, о чем свидетельствует сильное окрашивание ядерным красителем, наблюдаемое в этих клетках мозга только после операции на открытом черепе. Эти преимущества наблюдаются и через 30 дней после оплодотворения.
У трансгенных рыб, содержащих флуоресцентную сосудистую сеть мозга из-за экспрессии красного флуоресцентного белка mCherry, в эндотелиальных клетках цветовое кодирование на значениях глубины стека изображений демонстрирует, что даже кровеносные сосуды, глубоко погребенные в мозге почти до 250 микрон, все еще хорошо видны и прослеживаются. При выполнении этой процедуры всегда имейте в виду, что это операция у живого животного. Поэтому это требует уважения и сосредоточенного ума.
После этой процедуры запись морфологии нейронов, включая синаптические структуры, физиологические и внутриклеточные транспортные события могут быть выполнены у личинок старше семи дней после оплодотворения. С помощью этой методики мы надеемся обеспечить подход, позволяющий изучать также клеточные процессы в головном мозге, которые происходят на более поздних личиночинках, и которые участвуют в установлении, например, такого сложного поведения, как социальное поведение или принятие решений.
