Этот протокол обеспечивает спонтанную самоорганизацию тактоидов микротрубочек с помощью антипараллельного кросс-линкера MAP65. Эта система может помочь нам понять организацию микротрубочек и биологические системы, такие как митотические веретена. Основным преимуществом этой техники является то, что это минималистичная система, которая может воссоздать веретенообразные формы для микротрубочек, которые являются высоковоспроизводимыми и доступными для многих лабораторий.
Этот метод применим не только к клеточным системам, но и может служить моделью для мезомасштабных исследований жидких кристаллов. Чтобы приготовить тубулин, сначала выньте из морозильной камеры минус 80 градусов Цельсия аликвоту немаркированного тубулина, содержащего один миллиграмм лиофилизированного тубулина, и держите его на льду. Затем добавьте 200 микролитров холодного ПЭМ-80.
Чтобы растворить весь лиофилат, держите трубку на льду в течение 10 минут. Затем достаньте из морозильной камеры морозильной камеры с маркировкой родамина тубулин, содержащую 20 микрограммов лиофилизированного тубулинового порошка, и держите его на льду. Затем добавьте четыре микролитра холодного ПЭМ-80 и держите трубку на льду в течение 10 минут, чтобы растворить весь лиофилат.
После растворения лиофилизированных тубулинов добавьте 100 микролитров повторно суспендированного немаркированного раствора тубулина к четырехмикролитровому раствору тубулина, меченому родамином. Затем перемешайте растворы, положив трубы шесть-семь раз очень медленно. Чтобы сохранить оставшиеся 100 микролитров немаркированного раствора тубулина, сначала вставьте трубку в жидкий азот, чтобы заморозить раствор, затем держите трубку при минус 80 градусах Цельсия для дальнейшего использования.
Затем распределите тубулиновую смесь на семь новых пробирок, добавив в каждую по 15 микролитров. Заморозьте трубки в жидком азоте, как было продемонстрировано ранее, и храните их при минус 80 градусах Цельсия для будущего использования. Чтобы собрать проточные камеры для проведения экспериментов, сначала очистите стеклянную горку с двойным дистиллированным водой и высушите ее безворсовой лабораторной салфеткой.
Затем сначала очистите горку этанолом, а затем дважды дистиллированной водой. Чтобы создать траекторию потока, вырежьте кусок двусторонней ленты длиной от 40 до 50 миллиметров. Затем разделите его между собой, чтобы создать две более тонкие полоски ленты, и поместите две полоски на слайд на расстоянии от пяти до восьми миллиметров друг от друга.
Затем поместите силанизированные крышки на верхнюю часть пути потока. Затем запечатайте слайд и крышку сдвиньте двусторонние ленточные полоски, осторожно надавив на область ленты с обратной стороны ручки. Если уплотнение сделано хорошо, лента должна превратиться из полупрозрачной в прозрачную.
Чтобы снять лишнюю ленту по краям, отрежьте ленту лезвием бритвы, оставив всего один миллиметр от входа в проточную камеру. Затем маркируйте камеру соответствующими экспериментальными параметрами Для выполнения тактоидных экспериментов, во-первых, разморозьте все необходимые реагенты на льду и храните их на льду во время работы. Затем покройте проточную камеру 20 микролитрами 5% неионного блок-сополимерного поверхностно-активного вещества, растворенного в ПЭМ-80, небольшими каплями на обоих концах камеры, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха внутри.
Затем держите проточную камеру во влажной камере, изготовленной из чашки Петри, с влажной, безворсовой лабораторной салфеткой в течение не менее пяти-семи минут. Затем смешайте PEM-80, GMPPCPP, Pluronic F-127, дитиотрейтол, глюкозу, полиэтиленгликоль, смесь тубулинов, изготовленную ранее, и MAP65 с GFP MAP65 для визуализации в стерильной трубке путем пипетирования пять-шесть раз, сохраняя трубку на льду. Затем добавляют один микролитр предварительно смешанного раствора глюкозооксидазы и каталазы в пробирку смеси тубулин-МАП и снова перемешивают по трубам семь-восемь раз.
Разделите общий объем раствора на две порции для использования в отдельных камерах. Между тем, жидкость, добавленная ранее в проточную камеру, должна быть удалена капиллярным действием с помощью безворсовой лабораторной салфетки на другом конце камеры вместе с добавлением смеси тубулин-MAP в проточную камеру. Как только образец полностью окажется внутри камеры, запечатайте два конца камеры с помощью пятиминутной эпоксидной смолы и держите ее при 37 градусах Цельсия в течение примерно 30 минут, чтобы зародышевать и выращивать тактоиды микротрубочек.
Для визуализации тактоидов с помощью флуоресцентной микроскопии используйте объективы с числовой апертурой 1,2 или более при увеличении 60X или выше для сбора достаточного количества света в флуоресценции. Записывайте изображения с помощью дополнительного полупроводника оксида металла или камеры устройства с зарядовой связью. Чтобы сохранить образец, храните его в экологической камере, установленной при 37 градусах Цельсия.
В качестве альтернативы для этой цели могут использоваться другие нагреватели ступеней, в том числе нагреватели стадии горячего воздуха и объективные регулируемые по температуре воротники с циркулирующей теплой водой. Поскольку соответствующие источники возбуждения необходимы для правильной флуоресценции тубулина родамина, используйте 561-нанометровый лазер с мощностью не менее одного милливатта в образце для получения изображений хорошего качества. Однако для GFP MAP65 измените источник возбуждения на 488-нанометровый лазер.
Если используется широкоугольная эпифлуоресцентная микроскопия, то используют куб родаминового фильтра с возбуждением 540 12,5 нанометров, дихроиком 545 нанометров 12,5 нанометровой отсечки и излучением 575 нанометров длиннопроходной. Для GFP MAP используйте куб фильтра GFP с возбуждением 480 15 нанометров, дихроиком 505 нанометров 15 нанометров и излучением 515 нанометров в длинный проход. Убедившись, что мощность освещения и время экспозиции таковы, что шкала интенсивности для камеры не насыщена, сделайте не менее 10 изображений различных областей для изображения более 100 тактоидов как в красном, так и в зеленом каналах и сохраните их как 16-битные изображения TIFF для анализа.
Используя этот протокол, тактоиды микротрубочек, образование которых завершается в течение 30 минут, могут быть непосредственно визуализированы под микроскопом. Тактоиды видны как 561-нанометровым лазером в канале тубулина, так и 488-нанометровым лазером в канале MAP65. Изображения также идеально пересекаются друг с другом.
В этом методе также можно измерить длину и ширину тактоидов. Было обнаружено, что профиль интенсивности тактоида изменяется в зависимости от его ширины. Более того, неподвижный характер тактоидов микротрубочек был продемонстрирован восстановлением флуоресценции после фотоотбеливания или экспериментов FRAP, которые не показали никакого восстановления флуоресценции после фотоотбеливания.
С другой стороны, эксперименты FRAP выявили мобильную природу MAP65, для которой после фотоотбеливания можно наблюдать постепенное восстановление и флуоресценцию. Это восстановление флуоресценции MAP65 может быть приспособлено к растущему экспоненциальному распаду, чтобы найти амплитуду и временную шкалу восстановления. Тактоидная экспериментальная часть должна быть завершена в течение 10-12 минут, так как тубулин может быстро испортиться на льду, что может нанести вред зарождению тактоидов.
Будущая работа с различными микротрубочками, сшивающими белки и сшивающие моторные белки, ферменты, которые могут перемещать микротрубочки, будет продолжать раскрывать новую информацию о самоорганизации митотического веретена.
