הרכבה עצמית של טקטואידים מיקרוטובולים

פרוטוקול זה מאפשר ארגון עצמי ספונטני של טקטואידים של מיקרוטובולים באמצעות מחבר צולב אנטי-מקבילי, MAP65. מערכת זו יכולה לעזור לנו להבין את ארגון המיקרוטובולים ואת המערכות הביולוגיות כמו צירים מיטוטיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר במערכת מינימליסטית שיכולה ליצור מחדש צורות דמויות ציר עבור מיקרו-טובולים הניתנים לשחזור ונגישים למעבדות רבות.

שיטה זו אינה ישימה רק למערכות תאיות, אלא יכולה לשמש גם כמודל למחקרי גבישים נוזליים בקנה מידה מזו. כדי להכין טובולין, תחילה מוציאים אליקווט של טובולין ללא תווית המכיל מיליגרם אחד של טובולין ליופילי מהמקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס ושומרים אותו על קרח. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטרים של PEM-80 קר.

כדי להמיס את כל lyophilate, לשמור את הצינור על הקרח במשך 10 דקות. לאחר מכן, הוציאו צינורית של טובולין עם תווית רודמין המכילה 20 מיקרוגרם של אבקת טובולין ליופילית מהמקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס והשאירו אותה על קרח. לאחר מכן, הוסף ארבעה מיקרוליטרים של PEM-80 קר ולשמור את הצינור על קרח במשך 10 דקות כדי להמיס את כל lyophilate.

לאחר שהטובולינים הלופיליים התמוססו, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של תמיסת טובולין ללא תווית לתמיסת טובולין בעלת ארבעת המיקרוליטרים המסומנים ברודמין. לאחר מכן, ערבבו את הפתרונות על ידי צנרת שש עד שבע פעמים לאט מאוד. כדי לאחסן את 100 המיקרוליטרים הנותרים של תמיסת טובולין ללא תווית, תחילה, הכנס את הצינור לחנקן נוזלי כדי להקפיא את התמיסה, ולאחר מכן שמור את הצינור במינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.

לאחר מכן, הפיצו את תערובת הצינורות לשבעה צינורות חדשים על ידי הוספת 15 מיקרוליטרים בכל אחד מהם. הקפיאו את הצינורות בחנקן נוזלי כפי שהוכח בעבר ואחסנו אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. כדי להרכיב תאי זרימה לביצוע ניסויים, ראשית, נקו מגלשת זכוכית עם מים מזוקקים כפולים ויבשו אותה עם מגבון מעבדה נטול מוך.

לאחר מכן, נקו תחילה את המגלשה עם אתנול ואחריו מים מזוקקים כפולים. כדי ליצור נתיב זרימה, חותכים פיסת נייר דבק דו-צדדית באורך 40 עד 50 מילימטרים. לאחר מכן, פצלו אותו בין לבין כדי ליצור שתי רצועות נייר דבק דקות יותר והניחו את שתי הרצועות על המגלשה במרחק של חמישה עד שמונה מילימטרים זו מזו.

לאחר מכן, הניחו את החלקות הכיסוי המסולקות על גבי נתיב הזרימה. לאחר מכן, אטמו את המגלשה והכיסוי החליקו את רצועות הטייפ הדו-צדדיות על ידי לחיצה עדינה על אזור הקלטת בגב העט. אם החותם עשוי היטב, הקלטת צריכה להפוך משקיפות לשקוף.

כדי להסיר את הסרט הנוסף על הקצוות, חותכים את הסרט עם סכין גילוח, ומשאירים רק מילימטר אחד מהכניסה לתא הזרימה. לאחר מכן, תייג את התא בפרמטרים ניסיוניים מתאימים לביצוע הניסויים הטקטואידים, ראשית, להפשיר את כל הריאגנטים הדרושים על קרח ולאחסן אותם על הקרח במהלך העבודה. לאחר מכן, ציפו את תא הזרימה ב-20 מיקרוליטרים של חומר פעילי שטח של קופולימר קופולימר בלוקים לא יוניים 5% המומסים ב-PEM-80 עם טיפות קטנות בשני קצות התא כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר בפנים.

לאחר מכן, השאירו את תא הזרימה בתא לח העשוי מצלחת פטרי עם מגבון מעבדה רטוב ונטול מוך למשך חמש עד שבע דקות לפחות. לאחר מכן, מערבבים PEM-80, GMPPCPP, Pluronic F-127, dithiothreitol, גלוקוז, פוליאתילן גליקול, תערובת טובולין שנעשתה קודם לכן, ו- MAP65 עם GFP MAP65 להדמיה בצינור סטרילי על ידי צנרת חמש עד שש פעמים, תוך שמירה על הצינור על קרח. לאחר מכן, מוסיפים מיקרוליטר אחד של תמיסה מעורבת מראש של אוקסידאז גלוקוז וקטלאז לצינור של תערובת טובולין-MAP ומערבבים שוב על ידי צנרת שבע עד שמונה פעמים.

חלקו את הנפח הכולל של התמיסה לשני חלקים שישמשו בתאים נפרדים. בינתיים, יש להסיר את הנוזל שנוסף מוקדם יותר לתא הזרימה על ידי פעולת נימים באמצעות מגבון מעבדה נטול מוך בקצה השני של התא, יחד עם הוספת תערובת טובולין-MAP לתא הזרימה. לאחר שהדגימה נמצאת במלואה בתוך התא, אטמו את שני קצות התא באמצעות אפוקסי של חמש דקות ושמרו אותה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כ-30 דקות כדי לגרום ולגדל טקטואידים של מיקרוטובולים.

להדמיית הטקטואידים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, השתמש במטרות עם מפתח צמצם מספרי של 1.2 או יותר בהגדלה של פי 60 ומעלה כדי לאסוף מספיק אור בפלואורסצנציה. הקלט את התמונות באמצעות מוליך למחצה של תחמוצת מתכת חינם או מצלמת התקן מצומדת לטעינה. כדי לשמור על הדגימה, שמור אותה בתא סביבתי שנקבע על 37 מעלות צלזיוס.

לחלופין, ניתן להשתמש בתנורי שלבים אחרים, כולל מחממי שלב אוויר חם וקולרים מבוקרי טמפרטורה אובייקטיביים עם מים חמים במחזור, למטרה זו. מכיוון שמקורות עירור מתאימים חיוניים לפלואורסצנציה הנכונה עבור רודמין טובולין, השתמש בלייזר של 561 ננומטר עם לפחות מילי-וואט אחד של כוח בדגימה לתמונות באיכות טובה. עם זאת, עבור GFP MAP65, שנה את מקור העירור ללייזר של 488 ננומטר.

אם אתה משתמש במיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית בשדה רחב, השתמש בקוביית מסנן רודמין עם עירור של 540 12.5 ננומטר, דיכרואי של 545 ננומטר 12.5 ננומטר ניתוק, ופליטה של 575 ננומטרים מעבר ארוך. עבור GFP MAP, השתמש בקוביית מסנן GFP עם עירור של 480 15 ננומטרים, דיכרואיק של 505 ננומטרים 15 ננומטר מנותקים, ופליטה של 515 ננומטרים ארוכים. לאחר שווידאתם שעוצמת התאורה וזמני החשיפה הם כאלה שקנה המידה של העוצמה של המצלמה אינו רווי, צלמו לפחות 10 תמונות של אזורים שונים כדי לצלם מעל 100 טקטואידים הן בערוצים האדומים והן בערוצים הירוקים, ושמרו אותם כתמונת TIFF של 16 סיביות לניתוח.

באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לדמיין ישירות תחת המיקרוסקופ טקטואידים שהיווצרותם הושלמה תוך 30 דקות. הטקטואידים נראים הן עם לייזר של 561 ננומטר בתעלת טובולין והן עם לייזר של 488 ננומטר בתעלת MAP65. התמונות גם חופפות באופן מושלם זו לזו.

בשיטה זו ניתן היה למדוד גם את אורכם ורוחבם של הטקטואידים. נמצא כי פרופיל העוצמה של טקטואיד משתנה בהתאם לרוחבו. יתר על כן, האופי חסר התנועה של הטקטואידים המיקרוטובולים הודגם על ידי התאוששות פלואורסצנטית לאחר ניסויי הלבנת תמונות או FRAP, שלא הראו כל התאוששות של פלואורסצנציה לאחר הלבנת הפוטו.

מצד שני, ניסויי FRAP חשפו אופי נייד של MAP65, שעבורו ניתן היה לצפות בהתאוששות הדרגתית ובפלואורסצנציה לאחר הלבנת תמונות. התאוששות פלואורסצנטית זו על ידי MAP65 יכולה להתאים לדעיכה מעריכית גוברת כדי למצוא את המשרעת ואת סולם הזמן של ההתאוששות. חלק הניסוי הטקטואידי אמור להסתיים תוך 10 עד 12 דקות, מכיוון שהטובולין יכול להתקלקל על קרח במהירות, מה שעלול להזיק לנוקלאציה של טקטואידים.

עבודה עתידית עם חלבונים שונים המקשרים בין מיקרוטובולים וחלבונים מוטוריים צולבים, אנזימים שיכולים להזיז מיקרוטובולים, תמשיך לחשוף מידע חדש על הארגון העצמי של הציר המיטוטי.