Этот протокол позволяет очищать высококачественные комплексы септинов, и это важно для изучения многих ролей септинов в клетке. Основным преимуществом такого подхода является синтез простой процедуры очистки высококачественного септина с помощью адгенных плазмид. Септины трудно изучать в клетках из-за их многочисленных взаимодействий.
Восстановление серы помогает нам распутать эту сложность, изучая их в простой системе. Мы рекомендуем делать очищение за один день, чтобы предотвратить деградацию. По нашему опыту, это увеличит срок службы и качество белка.
Для начала вырастите трансформированную бактериальную культуру при 37 градусах Цельсия в шейкерном инкубаторе до тех пор, пока оптическая плотность на длине волны 600 нанометров не достигнет двух-трех для немаркированных септинов или от 0,6 до 0,8 для меченых септинов msfGFP или mEGFP. После инкубации индуцируют экспрессию белка путем добавления IPTG к конечной концентрации 0,5 миллимоляра и инкубируют клетки, экспрессирующие немаркированные гетероолигомеры септина при 37 градусах Цельсия в течение трех часов, или клетки, экспрессирующие msfGFP, меченые гетероолигомерами при 17 градусах Цельсия в течение ночи. Затем гранулируйте клетки в 4000 раз G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия.
Выбросьте супернатант и растворите гранулу в 100 миллилитрах лизисного буфера для лизирования клеток. Затем используйте наконечниконатора на амплитуде 30%, чтобы обработать клетку ультразвуком. Осветите клеточный лизат центрифугированием в 20 000 раз G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия и сохраните супернатант.
По желанию возьмите образец для денатурирующего электрофореза, как описано в рукописи. Для аффинной хроматографии септинов, помеченных His, уравновесьте предварительно упакованную никелевую сефарозную высокоэффективную хроматографическую колонку со всеми необходимыми буферами. Загрузите осветленный супернатант вниз в колонку и запустите систему хроматографии.
Затем элюируют комплексы септина 50% буфером элюирования HisTrap со скоростью потока один миллилитр в минуту. Чтобы получить концентрацию имидазола 250 миллимоляров, соберите 0,5 миллилитровых фракций. Теперь контролируйте оптическое поглощение элюата на 280 нанометрах с помощью системы быстрой жидкостной хроматографии белка и подбирайте фракции, содержащие комплексы септина.
Для аффинной хроматографии меченых белков Strep-II уравновешивают предварительно упакованную колонку StrepTactin sepharose высокопроизводительной хроматографической колонкой с септиновым буфером. Загрузите септинсодержащие фракции, извлеченные из никелевой колонки, со скоростью один миллилитр в минуту и запустите систему хроматографии. Затем промыть связанный белок и элюдировать комплексы септина 100% буфером элюирования StrepTrap со скоростью потока один миллилитр в минуту.
Чтобы получить концентрацию 2,5 миллимолярного дестиобиотина, собирают 0,5 миллилитровых фракций. Выбирайте фракции, содержащие комплексы септина, как указано оптической абсорбцией элюата на 280 нанометров, контролируемой онлайн с помощью системы быстрой жидкостной хроматографии белка. После удаления дестиобиотина путем диализа аликвот белковые комплексы в нужный размер аликвоты заморозьте аликвоту и сохраните ее при минус 80 градусах Цельсия.
Для интерферометрической микроскопии рассеивания промывайте стеклянные слайды No 1,5, обрабатывая их ультразвуком в ультразвуковом очистителе в течение пяти минут каждый в воде, изопропаноле и снова в деионизированной воде. Высушите две стеклянные горки легким потоком газообразного азота. Затем поместите семимиллитровую каплю 0,01% раствора поли-L-лизина в центр одного из слайдов и поместите центр другого слайда поверх капли Poly-L-Lysine, ориентируя два слайда ортогонально для легкого разделения.
После инкубации в течение 30 секунд промыть горку, погрузившись в стакан, содержащий деионизированную воду, один раз и дважды непосредственно применяя струю воды. Высушите их потоком газообразного азота, и эти слайды можно хранить около шести недель при комнатной температуре в сухих условиях. Перед экспериментом отрежьте кусок из двух на два, трех на два или трех на три прокладки и наклейте их на обработанную Поли-L-Лизином часть стеклянной горки, избегая контакта стеклянной горки и прокладок с любой грязной поверхностью, поместив затвор на легкую ткань стеклоочистителя.
Теперь прижмите прокладки наконечником пипетки, чтобы приклеить их к защитному пластику, присутствующему на прокладках. Далее прогрейте буфер септина до комнатной температуры. Разморозьте белки в руке и держите их на льду после этого.
Затем поместите слайд с прокладками на коммерческую массовую фотометрическую систему, содержащую 19 микролитров буфера септина, и сфокусируйте микроскоп с помощью опции автофокусировки. Перефокусируйтесь с новыми настройками, используя опцию автофокусировки. Чтобы создать папку проекта, щелкните Файл, за которым следует Новый проект, а чтобы загрузить папку проекта для хранения данных, щелкните Файл, а затем Загрузить проект.
Затем пипетку на один микролитр образца до 19 микролитров перегородки буферной капли. Перемешайте, и во время смешивания избегайте прикосновений к чему-либо, чтобы предотвратить движение слайда. Затем запишите 6 000 кадров видео, нажав кнопку «Запись».
Проанализируйте видео с помощью программного обеспечения производителя, чтобы получить распределение белковой массы. Если пики различных размеров гетероолигомера септина перекрывают слишком много или обнаруживается слишком много событий, уменьшают конечную концентрацию септина и измеряют снова. И когда достаточное количество отдельных молекул не измеряется, увеличьте концентрацию септина и измерьте снова.
Для анализа септина готовят 5X darkSPB и смесь септина, состоящую из 100% темного септина в шесть раз более высокой концентрации, чем желаемая конечная концентрация в буфере септина и одного миллимолярного дитиотрейтола. Затем полимеризуют септин путем смешивания воды, 20%5X темного SPB и 16,67% септина, в этом конкретном порядке, и инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре. Добавьте от трех до пяти микролитров образца в сетку электронной микроскопии с тлеющим разрядом и инкубируйте в течение одной минуты.
Теперь дважды вымойте сетку, добавив каплю темного буфера SPB и впитайте жидкость фильтровальной бумагой. Один раз промыть водой и инкубировать в течение 30 секунд с 2% уранилацетатом. Затем промойте пятно и высушите образец на воздухе в течение нескольких минут.
Затем визуализируйте пучки септина при 120 киловольтах и увеличениях между 5 000X и 60 000X со расфокусировкой от одного до двух микрометров. Хроматограмма HisTrap и StrepTrap показала, что объединенная фракция шла от начала пика элюирования до стабилизации поглощения на уровне около 250 миллилитров и 50 миллилитров соответственно. Септиновые полосы показали аналогичную интенсивность при денатурирующем гелевом электрофорезе, предполагая, что септины неповреждены.
В нативном электрофорезе наблюдалась основная полоса, соответствующая интактным гетероолигомерам, и минорная полоса, соответствующая триморам или тетрамерам. Кажущаяся молекулярная масса комплексов, помеченных msfGFP, неотличима от молекулярной массы непомеченных комплексов. Массовая фотометрия обнаружила интактные октамеры и гексамеры септинов.
Дополнительный пик в 241 килодалтону указывал на наличие двух белков арахиса, DSep1 и mEGFP-DSep2. Пропусктивная электронная микроскопия изображений септиновых комплексов показала стержни гексамеров и октамеров. Метки msfGFP видны в виде нечетких плотностей на двух концах в септине 2 msfGFP человеческом септине octamers_9i1.
Небольшие кластеры белков можно наблюдать в неглубоком поле TIRF. Конфокальная микроскопия выявила большие скопления плавающих нитевидных структур. Просвечивающая электронная микроскопия показала малые и большие пучки септинов, соответствующие кластерам, наблюдаемым с помощью флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения и конфокальной микроскопии.
Мы рекомендуем постоянно работать на льду во время очистки и добавлять свежие реагенты, которые мы указываем в протоколе. Нас интересуют взаимодействия септинов в контексте цитокинеза. Мы восстановили септин вместе с современными мембранами актина и микротрубочек для их изучения с помощью микроскопии и нескольких биофизических анализов.
Мы используем очищенные септины для изучения того, как септины взаимодействуют с актиновыми нитями, микротрубочками и липидами. И мы также используем очищенные септины для создания синтетических клеток, где септины облегчают деление клеток.
