Questo protocollo consente di purificare complessi di settina di alta qualità, e questo è essenziale per studiare i molti ruoli delle settine nella cellula. Il principale vantaggio di questo approccio è la sintesi di una semplice procedura per purificare la settina di alta qualità utilizzando plasmidi Addgene. Le settine sono difficili da studiare nelle cellule a causa delle loro numerose interazioni.
La ricostituzione dello zolfo ci aiuta a districare questa complessità studiandole in un sistema semplice. Si consiglia di fare la purificazione in un solo giorno per prevenire il degrado. Nella nostra esperienza, questo aumenterà la durata e la qualità della proteina.
Per iniziare, coltivare la coltura batterica trasformata a 37 gradi Celsius in un incubatore shaker fino a quando la densità ottica a una lunghezza d'onda di 600 nanometri raggiunge da due a tre per le settine non marcate, o da 0,6 a 0,8 per le settine marcate con msfGFP o mEGFP. Dopo l'incubazione, indurre l'espressione proteica aggiungendo IPTG a una concentrazione finale di 0,5 millimolari e incubare le cellule che esprimono etero-oligomeri di septina non marcati a 37 gradi Celsius per tre ore, o le cellule che esprimono etero-oligomeri marcati msfGFP a 17 gradi Celsius durante la notte. Quindi pellettare le cellule a 4.000 volte G per 20 minuti a quattro gradi Celsius.
Scartare il surnatante e sciogliere il pellet in 100 millilitri di tampone di lisi per lisare le cellule. Quindi, utilizzare un sonicatore di punta al 30% di ampiezza per sonicare la cella. Chiarire il lisato cellulare centrifugando a 20.000 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius e salvare il surnatante.
Facoltativamente, prelevare un campione per l'elettroforesi denaturante come descritto nel manoscritto. Per la cromatografia di affinità delle settine marcate con His, equilibrare una colonna cromatografica preconfezionata di sinfosio di nichel ad alte prestazioni con tutti i tamponi necessari. Caricare il surnatante chiarificato nella colonna e avviare il sistema cromatografico.
Quindi eluire i complessi di settina con tampone di eluizione 50% HisTrap ad una velocità di flusso di un millilitro al minuto. Per ottenere una concentrazione di imidazolo di 250 millimolari, raccogliere frazioni da 0,5 millilitri. Ora monitora l'assorbanza ottica dell'eluato a 280 nanometri con un sistema di cromatografia liquida proteica veloce e scegli le frazioni contenenti complessi di settini.
Per la cromatografia di affinità delle proteine marcate Strep-II si equilibra una colonna cromatografica ad alte prestazioni di StrepTactin sepharose preconfezionata con tampone di septina. Caricare la settina contenente le frazioni recuperate dalla colonna di nichel ad una velocità di un millilitro al minuto e avviare il sistema cromatografico. Quindi lavare la proteina legata ed eluire i complessi di settino con tampone di eluizione 100% StrepTrap ad una velocità di flusso di un millilitro al minuto.
Per ottenere una concentrazione di 2,5 millimolari destiobiotina, raccogliere frazioni di 0,5 millilitri. Prelevare le frazioni contenenti complessi di settino come indicato dall'assorbanza ottica dell'eluato a 280 nanometri monitorata online con un sistema di cromatografia liquida proteica veloce. Dopo aver rimosso la destiobiotina mediante alisi aliquot, i complessi proteici nella dimensione aliquota desiderata, congelare l'aliquota e conservarla a meno 80 gradi Celsius.
Per la microscopia a diffusione interferometrica, lavare i vetrini numero 1,5 sonicandoli in un pulitore ad ultrasuoni per cinque minuti ciascuno in acqua, isopropanolo e di nuovo in acqua deionizzata. Asciugare due vetrini con un getto delicato di azoto gassoso. Quindi posizionare una goccia da sette microlitri di soluzione di poli-L-lisina allo 0,01% al centro di uno dei vetrini e posizionare il centro dell'altro vetrino sopra la goccia di poli-L-lisina, orientando i due vetrini ortogonalmente per una facile separazione.
Dopo l'incubazione per 30 secondi, lavare il vetrino immergendolo in un becher contenente acqua deionizzata una volta e applicando direttamente un getto d'acqua due volte. Asciugarli con un flusso di gas azoto e questi vetrini possono essere conservati per circa sei settimane a temperatura ambiente in condizioni asciutte. Prima dell'esperimento, tagliare un pezzo di due per due, tre per due o tre per tre guarnizioni e attaccarle sulla parte trattata con poli-L-lisina di un vetrino, evitando che il vetrino e le guarnizioni entrino in contatto con qualsiasi superficie sporca posizionando il vetrino su un tessuto tergicristallo leggero.
Ora premere le guarnizioni con una punta di pipetta per attaccarle con la plastica protettiva presente sulle guarnizioni. Quindi, riscaldare il tampone di settina a temperatura ambiente. Scongelare le proteine in mano e tenerle sul ghiaccio in seguito.
Quindi posizionare il vetrino con le guarnizioni sul sistema di fotometria di massa commerciale contenente 19 microlitri di tampone di settina e mettere a fuoco il microscopio utilizzando l'opzione di messa a fuoco automatica. Rimettere a fuoco con le nuove impostazioni, utilizzando l'opzione di messa a fuoco automatica. Per creare una cartella di progetto, fare clic su File seguito da Nuovo progetto e per caricare una cartella di progetto per l'archiviazione dei dati, fare clic su File seguito da Carica progetto.
Quindi pipettare un microlitro di campione a 19 microlitri di goccia tampone del setto. Mescolare e, durante la miscelazione, evitare di toccare qualsiasi cosa per impedire il movimento della diapositiva. Quindi registra un video di 6.000 fotogrammi facendo clic su Registra.
Analizza i video utilizzando il software del produttore per ottenere la distribuzione della massa proteica. Se i picchi di diverse dimensioni degli etero-oligomeri della settina si sovrappongono troppo o vengono rilevati troppi eventi, diminuire la concentrazione finale di settina e misurare nuovamente. E quando non vengono misurati abbastanza conteggi di singole molecole, aumentare la concentrazione di settino e misurare di nuovo.
Per l'analisi della settina, preparare il 5X darkSPB e una miscela di settina composta da settina scura al 100% a una concentrazione sei volte superiore rispetto alla concentrazione finale desiderata in tampone di settina e un ditiotreitolo millimolare. Quindi polimerizzare la septina mescolando acqua, 20% 5X darkSPB e 16,67% miscela di septina, in questo ordine specifico, e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere da tre a cinque microlitri di campione a una griglia di microscopia elettronica scarica a bagliore e incubare per un minuto.
Ora, lavare la griglia due volte aggiungendo una goccia di tampone darkSPB e assorbire il liquido con una carta da filtro. Lavare una volta con acqua e incubare per 30 secondi con acetato di uranile al 2%. Quindi, asciugare la macchia e asciugare all'aria il campione per alcuni minuti.
Quindi immagina i fasci di septina a 120 kilovolt e ingrandimenti tra 5.000X e 60.000X con una sfocatura di uno o due micrometri. Il cromatogramma HisTrap e StrepTrap ha mostrato che la frazione aggregata è andata dall'inizio del picco di eluizione fino a quando l'assorbanza si è stabilizzata rispettivamente a circa 250 millilitri e 50 millilitri. Le bande di settina hanno mostrato intensità simili nella denaturazione dell'elettroforesi su gel, suggerendo che le settine sono intatte.
Nell'elettroforesi nativa, sono stati osservati la banda maggiore corrispondente agli etero-oligomeri intatti e una banda minore corrispondente ai trimori o tetrameri. Il peso molecolare apparente dei complessi marcati con msfGFP è indistinguibile da quello dei complessi non marcati. La fotometria di massa ha rilevato ottameri intatti ed esameri di septine.
Un ulteriore picco a 241 kilodalton ha indicato la presenza di due proteine di arachidi, DSep1 e mEGFP-DSep2. Le immagini al microscopio elettronico a trasmissione di complessi di settina hanno mostrato bastoncelli di esameri e ottameri. I tag msfGFP sono visibili come densità sfocate sulle due estremità nella settina 2 msfGFP umana octamers_9i1.
Piccoli gruppi di proteine possono essere osservati nel campo TIRF poco profondo. La microscopia confocale ha rivelato grandi gruppi di strutture filamentose galleggianti. La microscopia elettronica a trasmissione ha mostrato piccoli e grandi fasci di settina corrispondenti ai cluster osservati dalla microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale e dalla microscopia confocale.
Si consiglia di lavorare sul ghiaccio in ogni momento durante le purificazioni e di aggiungere reagenti freschi che specifichiamo nel protocollo. Siamo interessati alle interazioni delle settine nel contesto della citochinesi. Abbiamo ricostituito la settina insieme alle moderne membrane actina e microtubuli per studiarli con microscopia e diversi saggi biofisici.
Usiamo le settine purificate per studiare come le settine interagiscono con filamenti di actina, microtubuli e lipidi. E usiamo anche le settine purificate per costruire cellule sintetiche in cui le settine facilitano la divisione cellulare.
