Это протокол, который изучает, как тонкая кишка обрабатывает материалы различных физических свойств и как она распределяет эти материалы в пространстве. Это дополнительный инструмент в нашем исследовании механочувствительности кишечника. Основные преимущества этого протокола заключаются в том, что он может быть использован для изучения материалов или смесей с различными физическими свойствами и что разрешение позволяет нам разрешать региональные транзиты по коротким сегментам кишечника.
Этот метод добавляет к нашему пониманию механочувствительности кишечника. Это помогает нам понять, как тонкая кишка принимает решения о транзите на основе механических сигналов, которые она получает от внутрипросветного содержимого. Для начала подготовьте гаваж, прикрепив к шприцу 1-миллилитровую трубку толщиной 18 калибров и длиной 50 миллиметров и вытянув 200 микролитров раствора RITC или микросферного раствора.
Затем вручную удерживайте голодающее животное, используя технику удержания одной рукой, затем осторожно вставьте питательную трубку через рот и пищевод мыши, пока она не попадет в желудок. После введения медленно выталкивайте содержимое шприца в желудок и осторожно извлекайте трубку из мыши. После гаважа верните мышь в клетку.
Перед началом рассечения включите инструмент визуализации in vivo, чтобы он достиг желаемой температуры. После эвтаназии поместите мышь в лежачее положение на стадии рассечения и прикрепите ее четыре придатка к сцене, чтобы получить доступ к животу. Далее смачиваем поверхность живота 70% этанолом.
Далее используйте микродиссекционные щипцы, чтобы потянуть кожу и сделать поперечный разрез с помощью острых хирургических ножниц на 1 сантиметр выше ануса. Чтобы обнажить внутрибрюшинную полость, продолжайте разрез вертикально вверх по брюшной полости до грудной клетки. Осторожно обрабатывайте кишечник и оцените его ориентацию в брюшной полости, прежде чем манипулировать ими.
Отрежьте проксимальное к гастроэзофагеальному соединению, отделив таким образом желудок от пищевода и осторожно распутайте толстую кишку, слепую кишку и тонкую кишку, медленно потянув в противоположном направлении. Используйте микродиссекционные ножницы, чтобы отделить прикрепления брыжейки к кишечнику. Позже, используя щипцы, перенесите рассеченные кишки на измерительный лист.
Поместите желудок на 0 миллиметров и расположите кишечник вдоль линейки до 200 миллиметров, затем разрежьте кишечник на 200 миллиметров ножницами для микродиссекции и повторите эту процедуру выравнивания кишечника. Как только ткань расположится на линейке, расположите слепую кишку параллельно с тканью, но не в непосредственном контакте с ней. Поместите измерительный лист с рассеченной тканью в темную область, чтобы флуоресценция могла сохраняться до тех пор, пока не придет время для изображения.
Чтобы запустить ex vivo imaging, откройте программное обеспечение для обработки изображений. Войдите в систему и инициализируйте инструмент обработки изображений, чтобы быть готовым к получению изображения. Для riTC gavage установите возбуждение на 535 нанометров и emissions, 600 нанометров.
В то время как для зеленых микросферных бусин установите возбуждение на 465 нанометров и излучение на 520 нанометров. Теперь установите экспозицию в Auto и выберите поле зрения. Убедившись, что кишечник не сместился во время транспортировки, поместите измерительный лист в прибор в поле зрения.
Надежно закройте дверцу прибора и выберите Снимок, чтобы сфотографировать поле зрения. Сохраните собранные снимки на флешку для анализа. Затем сохраните отдельные снимки флуоресцентных и фотоизображений.
Наложение фотографии и флуоресценция указывают на расположение флуоресцентных материалов в желудочно-кишечном тракте. Откройте файлы флуоресцентных и фотографий изображений в программном обеспечении для редактирования изображений для анализа. Отрегулируйте размер в пикселях обоих изображений, чтобы иметь точные размеры, и закройте файл фотографии.
Для флуоресцентного изображения используйте инструмент ластика, чтобы удалить фон и сделать его прозрачным. Создайте новый слой. Выберите черную заливку слоя и перетащите слой, чтобы он лежал под слоем с флуоресцентным изображением и сделал полностью черный фон.
Сохраните новое флуоресцентное изображение, содержащее только флуоресцентный сигнал на черном фоне, в качестве нового файла TIF. Откройте новые флуоресцентные и фотоизображения в ImageJ. Превратите каждое изображение в 30-битное изображение, выбрав «Изображение», затем «Тип» и «30-битное».
Создайте объединенное изображение обоих, выбрав «Изображение», а затем «Цветной» и «Объединить каналы». В открывшемся диалоговом окне выберите файл фотографии для серого канала и флуоресцентный файл Под любыми цветными каналами. Отключите масштаб объединенного изображения, выбрав «Анализ», затем «Задать масштаб» и «Щелкните, чтобы удалить масштаб».
Выберите инструмент «Прямоугольник» в ImageJ. Нарисуйте прямоугольник вокруг участка тонкой кишки, обращая пристальное внимание на ширину этой интересующей области, так как она должна оставаться постоянной между всеми областями интереса. Дублируйте интересующую область, выбрав Изображение, затем Дублировать и выберите только канал, соответствующий цветному каналу.
Опять же, используйте инструмент «Прямоугольник», чтобы нарисовать интересующую область над всем новым изображением и получить профиль флуоресценции, выбрав «Анализ», а затем «Профиль графика». Откройте список значений и скопируйте их в программы для работы с электронными таблицами. Повторите шаги от рисования интересующей области до получения профиля флуоресценции для каждого участка тонкой кишки, как описано ранее на отдельном ряду линейки.
В программном обеспечении для работы с электронными таблицами умножьте каждое среднее значение интенсивности на постоянную ширину интересующей области прямоугольника, созданную на предыдущем шаге. Это даст реальное значение интенсивности вдоль тонкой кишки в каждой точке. Здесь показаны средние следы флуоресценции по длине тонкой кишки.
Распределение флуоресцентного материала изменяется в зависимости от свойств материала внутрипросветного содержимого. Увеличение количества контейнеров, используемых для сортировки одних и тех же необработанных наборов данных, показывает детализированные функции трассировки, неразрешимые с меньшим количеством контейнеров. Меньшие бункеры уменьшают погрешность измерений, увеличивают пространственное разрешение и лучше отражают дистрибутивный компонент подвижности тонкой кишки.
Геометрический центр не в состоянии полностью охарактеризовать пространственное распределение внутрипросветного содержимого. Это ограничение измерения геометрического центра очевидно при сравнении жидкостей и более крупных шариков. Флуоресцентный след более крупных бусин более распределен, но он усредняется до той же точки, что и у жидкости, независимо от гранулярности биннинга, что подчеркивает ограничение сосредоточения исключительно на геометрическом центре.
Чтобы учесть дистрибутивный характер сокращений тонкой кишки, в настоящее исследование был включен спектральный анализ мощности. Построение спектра мощности показывает, что по мере уменьшения размеров бункеров мы можем наблюдать значительно доминирующие частоты в более крупном спектре бусин, но не в малых бусинах. Некоторые, но не все, из этих дополнительных доминирующих частот присутствуют в жидком спектре.
Наиболее деликатными шагами этого протокола являются гаваж и рассечение. Они должны быть стандартизированы экспериментаторами перед выполнением этой техники в экспериментальных целях. Это терминальный эксперимент, так как животное нужно принести в жертву.
Когда это возможно, максимизируйте использование вашей животной модели, выполнив другие нетерминальные эксперименты до этого. Наша группа недавно использовала эту технику для поддержки нашего поиска сенсорных наборов кишечника, где кишечник использует эпителиальные механорецепторы для ощущения более тонких физических свойств, так же, как это делают наши пальцы.
