זהו פרוטוקול החוקר כיצד המעי הדק מטפל בחומרים בעלי תכונות פיזיקליות שונות וכיצד הוא מפיץ חומרים אלה בחלל. זהו כלי משלים במחקר שלנו על רגישות למעיים. היתרונות העיקריים של פרוטוקול זה הם כי ניתן להשתמש בו כדי ללמוד חומרים או תערובות עם תכונות פיזיות שונות וכי הפתרון מאפשר לנו לפתור מעברים אזוריים על פני קטעי מעיים קצרים.
טכניקה זו מוסיפה להבנתנו את הרגישות של המעי האנושי. זה עוזר לנו להבין כיצד המעי הדק מקבל החלטות מעבר על סמך הרמזים המכניים שהוא מקבל מהתוכן התוך-לומינלי. כדי להתחיל, הכינו את ה-gavage על ידי חיבור צינור הזנה בעובי של 18 מדים ובאורך 50 מילימטרים למזרק של 1 מיליליטר ושואבים 200 מיקרוליטרים של תמיסת RITC או תמיסת מיקרוספרה.
לאחר מכן, לרסן ידנית את החיה בצום באמצעות טכניקת ריסון ביד אחת, ולאחר מכן בעדינות להכניס את צינור ההזנה דרך הפה והוושט של העכבר עד שהוא נכנס לקיבה. לאחר ההחדרה, לאט לגרש את תוכן המזרק לתוך הבטן בזהירות להסיר את הצינור מן העכבר. לאחר הגבאג', החזירו את העכבר לכלוב.
לפני תחילת הניתוחים, הפעל את מכשיר ההדמיה in vivo כדי שיגיע לטמפרטורה הרצויה. לאחר המתת חסד, הניחו את העכבר בתנוחת שכיבה על במת דיסקציה והצמידו את ארבעת הנספחים שלו על הבמה כדי לגשת לבטן. לאחר מכן, להרטיב את פני השטח של הבטן עם 70% אתנול.
לאחר מכן, השתמש מלקחיים מיקרו דיסקציה כדי למשוך את העור ולעשות חתך רוחבי באמצעות מספריים כירורגיים חדים 1 ס"מ מעל פי הטבעת. כדי לחשוף את החלל intraperitoneal, להמשיך את החתך אנכית במעלה הבטן עד כלוב הצלעות. טפל בעדינות במעיים והעריך את האוריינטציה שלהם בחלל הבטן לפני שתמרן אותם.
חותכים את הפרוקסימלי לצומת הגסטרו-ווסגיאלי, ובכך מפרידים את הקיבה מהוושט ופורמים בעדינות את המעי הגס, הצקום והמעי הדק על ידי משיכה איטית בכיוון ההפוך. השתמש מספריים מיקרו דיסקציה כדי להפריד את החיבורים של mesentery למעיים. מאוחר יותר, באמצעות מלקחיים, להעביר את המעיים מנותקים לגיליון המדידה.
מניחים את הבטן על 0 מילימטרים ומסדרים את המעיים לאורך הסרגל עד 200 מילימטרים, ואז חותכים את המעיים ב -200 מילימטרים עם מספריים מיקרו-דיסקציה וחוזרים על הליך זה של יישור המעי. לאחר שהרקמה מסודרת על הסרגל, מסדרים את הצקום כך שמקביל לרקמה, אך לא במגע ישיר איתה. הניחו את גיליון המדידה עם הרקמה המנותקת באזור חשוך, כך שניתן יהיה לשמר את הפלואורסצנטיות עד שיגיע הזמן לתמונה.
כדי להתחיל בהדמיית ex vivo, פתח את תוכנת ההדמיה. היכנס ואתחל את מכשיר ההדמיה כדי להיות מוכן לרכישת תמונה. עבור RITC gavage, הגדר עירור ב 535 ננומטר ופליטות, 600 ננומטר.
בעוד שעבור חרוזי מיקרוספרה ירוקים, קבעו עירור על 465 ננומטר ופליטה על 520 ננומטר. כעת, הגדר את החשיפה ל'אוטומטי' ובחר את שדה הראייה. לאחר שווידאת כי המעיים לא זזו במהלך ההובלה, מקם את גיליון המדידה לתוך המכשיר בתוך שדה הראייה.
סגור היטב את דלת המכשיר ובחר Snapshot כדי לצלם את שדה הראייה. שמור את התמונות שנאספו בכונן הבזק לניתוח. לאחר מכן, שמור לכידות בודדות של תמונות הפלואורסצנט והצילום.
שכבת-על של התצלום והפלואורסצנציה מציינת את מיקומם של חומרים פלואורסצנטיים במערכת העיכול. פתח את קבצי התמונות הפלואורסצנטיים והתצלומים בתוכנת עריכת תמונות לניתוח. התאם את גודל הפיקסלים של שתי התמונות כך שיהיו במידות המדויקות וסגור את קובץ התצלום.
לתמונה הפלואורסצנטית, השתמשו בכלי מחק כדי להסיר את הרקע ולהפוך אותו לשקוף. צרו שכבה חדשה. בחרו מילוי שחור לשכבה וגררו את השכבה כך שתישאר מתחת לשכבה עם התמונה הפלואורסצנטית וצרו רקע שחור לחלוטין.
שמור את התמונה הפלואורסצנטית החדשה המכילה רק את האות הפלואורסצנטי על רקע שחור כקובץ TIF חדש. פתח את תמונות הפלורסנט החדשות וצלם תמונות ב- ImageJ. הפוך כל תמונה לתמונה של 30 סיביות על-ידי בחירה באפשרות 'תמונה', ואחריה 'אות' ו'30 סיביות'.
צרו תמונה ממוזגת של שניהם באמצעות בחירה באפשרות 'תמונה', ואחריה 'צבע' ו'מזג ערוצים'. בתיבת הדו-שיח שנפתחת, בחר את קובץ התצלום של הערוץ האפור ואת קובץ הפלואורסצנט תחת ערוצים צבעוניים כלשהם. בטל את קנה המידה של התמונה הממוזגת על-ידי בחירה באפשרות נתח, ולאחר מכן קבע קנה מידה ולחץ כדי להסיר קנה מידה.
בחרו בכלי מלבן ב-ImageJ. צייר מלבן סביב קטע של המעי הדק תוך שימת לב לרוחב של אזור עניין זה, כפי שהוא צריך להישאר קבוע בין כל אזורי העניין. שכפל את אזור העניין על-ידי בחירה באפשרות תמונה, ולאחר מכן שכפל ובחר רק את הערוץ המתאים לערוץ הצבעוני.
שוב, השתמש בכלי מלבן כדי לצייר אזור עניין מעל התמונה החדשה כולה ולאחזר פרופיל פלואורסצנטי על-ידי בחירה באפשרות נתח, ולאחר מכן פרופיל התוויה. פתח את רשימת הערכים והעתק אותם לתוכנת גיליון אלקטרוני. חזור על שלבים משרטוט אזור העניין ועד לאחזור פרופיל פלואורסצנטי עבור כל מקטע של המעי הדק כפי שתואר קודם לכן בשורה אחרת של סרגל.
בתוכנת הגיליון האלקטרוני, הכפל כל ערך עוצמה ממוצע באזור העניין של מלבן הרוחב הקבוע שנוצר בשלב הקודם. זה יניב את ערך העוצמה האמיתי לאורך המעי הדק בכל נקודה. מוצגים כאן עקבות פלואורסצנטיות ממוצעות לאורך המעי הדק.
התפלגות החומר הפלואורסצנטי משתנה בהתאם לתכונות החומר של התוכן התוך-לומינלי. הגדלת מספר הפחים המשמשים למיון אותן ערכות נתונים גולמיות חושפת תכונות מעקב פרטניות שאינן ניתנות לפתרון עם פחות פחים. פחים קטנים יותר מפחיתים את אי-הוודאות במדידה, מגדילים את הרזולוציה המרחבית ומשקפים טוב יותר את המרכיב החלוקתי של תנועתיות המעי הדק.
המרכז הגיאומטרי אינו מצליח לאפיין לחלוטין את ההתפלגות המרחבית של התוכן התוך-לומינלי. מגבלה זו של מדידת המרכז הגיאומטרי ניכרת בהשוואה בין נוזלים לחרוזים גדולים יותר. העקבות הפלואורסצנטיים של החרוזים הגדולים יותר מפוזרים יותר, אך הממוצע שלו מגיע לנקודה דומה לזו של הנוזל, ללא קשר לגרעיניות המתמזגת, מה שמדגיש את המגבלה של התמקדות אך ורק במרכז הגיאומטרי.
כדי להסביר את האופי החלוקתי של התכווצויות המעי הדק, שולב במחקר הנוכחי ניתוח ספקטרלי של הספק. התוויית ספקטרום ההספק מדגימה שכאשר גדלי הפחים מתכווצים, אנו יכולים לצפות בתדרים דומיננטיים באופן משמעותי בספקטרום החרוזים הגדול יותר, אך לא בזה של החרוזים הקטנים. חלק מאותם תדרים דומיננטיים נוספים, אך לא כולם, נמצאים בספקטרום הנוזלי.
השלבים העדינים ביותר של פרוטוקול זה הם הגבאג' והדיסקציה. אלה צריכים להיות סטנדרטיים על ידי הנסיינים לפני ביצוע טכניקה זו למטרות ניסוי. זהו ניסוי סופני, שכן יש להקריב את החיה.
במידת האפשר, מקסם את השימוש במודל החי שלך על ידי ביצוע ניסויים לא סופניים אחרים לפני זה. הקבוצה שלנו השתמשה לאחרונה בטכניקה זו כדי לתמוך במציאת קבוצות מגע במעיים שבהן המעיים משתמשים במכנורצפטורים אפיתליאליים כדי לחוש תכונות פיזיות עדינות יותר, בדומה לאצבעות שלנו.
