Количественная оценка активных форм кислорода с использованием 2',7'-дихлорфлуоресцеина диацетатного зонда и проточной цитометрии в глиальных клетках Мюллера

Существует несколько методов измерения производства АФК или окислительного стресса в клетках. Среди них 2'7'дихлорфлуоресцеин диацетатный зонд является одним из наиболее широко используемых методов для непосредственного измерения окислительно-восстановительного состояния. Этот зонд является липофильным и нефлуоресцентным. Диффузия этого зонда через клеточную мембрану позволяет внутриклеточным эстеразам расщепляться на двух эфирных связях, производя относительно полярный и непроницаемый клеточной мембраной продукт. Эти нефлуоресцентные молекулы накапливаются внутриклеточным образом, и последующее окисление АФК дает высокофлуоресцентный продукт дихлорфлуоресцеин. Окисление зонда является продуктом действия нескольких типов АФК. Которые могут быть обнаружены с помощью проточной цитометрии или конфокальной микроскопии. В этой статье мы использовали дихлорфлуоресцеин диацетатный зонд для измерения и количественной оценки АФК с помощью проточной цитометрии. Переложите 6-луночные плиты в ламинарный проточный вытяжной из инкубатора. Аспирировать супернатанта. И вымойте клетки один раз с помощью PBS. Добавьте 2 мл низкого сывороточного DMEM на лунку. И инкубировать 6-луночную пластину в течение двух часов в инкубаторе. Обрабатывайте клетки антиоксидантом в течение шести часов. Обработайте клетки индуктором АФК, А или В, в течение 30 минут. Аспирировать супернатанта. И промыть клетку три раза PBS, чтобы удалить все раздражители. Выключите свет ламинарного вытяжки и работайте в темноте. Добавьте 1 мл дихлорфлуоресцеина диацетатного зонда в DMEM без фенолового красного цвета. Добавьте 1 мл DMEM без фенольного красного цвета в контрольные ячейки управления автофлуоресценцией. Инкубируйте 6-луночную пластину в течение 30 минут в инкубаторе. Переложите пластины на льду в лабораторию. Промыть клетки три раза 2 мл холодного PBS на лунку. Добавьте 0,5 мл буфера холодного отсоединения в каждую скважину. Соберите клетки, аккуратно пипетируя вверх и вниз с помощью пипетки P1000. Соберите их в маркированную пробирку объемом 1,5 мл. И центрифугируйте их при 600 х г в течение пяти минут при 4 С. Осторожно выбросьте надосадочный материал и аккуратно отделите гранулу постукиванием. Добавьте 1 мл буфера FACS для промывки клеток к каждой маркированной трубке. При необходимости используйте вихрь наименьшей интенсивности для полной диссоциации гранулы. Центрифугируйте их при 600 х г в течение пяти минут при 4 С.Повторите этот шаг еще два раза. Всего три стирки. Повторное суспендирование клеточных гранул в 200 л буфера FACS. Аккуратно полностью диссоциировать гранулу в каждой трубке с помощью вихря. И переложить на маркированные 5 мл для проточных цитометрических трубок. Держите трубки на льду до анализа на проточном цитометре. Используя программное обеспечение для проточной цитометрии, создайте новый эксперимент. Нажмите на образец и откроется список трубок. Дважды щелкните и переименуйте их. Поместите трубку управления автофлуоресценцией на рычаг аспиратора, осторожно перемещая основание только влево. Щелкните Получить данные, а затем Записать данные и выберите нужное условие остановки. Нарисуйте ворота вокруг интересующих клеток, исключив мертвые клетки и мусор. Извлеките трубку. Нажмите кнопку Next Tube и запустите базовый контрольный образец. Щелкните Получить данные, а затем в поле Запись данных.Откройте программное обеспечение. Добавьте образцы с помощью кнопки действия Добавить образцы. Нажмите кнопку Добавить образец.Выберите папку Экспериментальная дата и нажмите кнопку Выбрать.Дважды щелкните первый образец в рабочей области, в данном случае элемент управления автофлуоресценцией. Нарисуйте полигональные ворота, чтобы изолировать интересующую ячейку, исключив мертвые клетки и мусор. Изменение графика на гистограмму. Двойной щелчок внутри M