Ножевая травма - это метод механического повреждения, который вызывает неспецифическую клеточную абляцию. Этот метод облегчает оценку пролиферации и дифференциации RGC после черепно-мозговой травмы. Травма от ножевого ранения, опосредованная иглой, является простым, эффективно применяемым методом индуцирования черепно-мозговой травмы.
Этот метод может быть применен ко многим экспериментальным образцам с использованием стандартного набора инструментов. Регенеративная способность рыбок данио-рерио была проиллюстрирована с помощью модели ножевых ранений. Новое понимание молекулярного механизма, регулирующего регенерацию нейронов, способствует регенеративной терапии в центральной нервной системе.
Начните с того, что поместите взрослую рыбку данио-рерио или медаку под наркозом на поднос из пенополистирола. Закрепите рыбу вертикально между двумя иглами 30-го калибра, вставленными вертикально в пенополистирол. Держите тело рыбы, чтобы голова рыбы не двигалась, а затем вертикально вставьте иглу 30-го калибра через череп в медиальную область одной из сфер оптического тектума.
Затем перенесите раненую рыбу в аквариум со свежей рыбной водой. Как только рыба полностью оправится от анестезии, переместите аквариум в систему разведения. Положите бумажные полотенца на поддон из пенополистирола, чтобы поместить анестезированную рыбу.
Затем удерживайте тело рыбы на месте, вертикально вставляя две иглы 30-го калибра по обе стороны от анального плавника. После того, как рыба помещена, сделайте вентральный разрез от ануса до сердца. Держите сердце видимым, вставив две иглы 30-го калибра с каждой стороны.
Затем кончиком щипцов удалите слой серебристого эпителия. Введите иглу 30-го калибра в желудочек, держа скос вверх, и сделайте надрез в предсердии с помощью щипцов. Затем протолкните PBS в предсердие, нажав на шприц, чтобы смыть кровь из предсердия.
Когда кровь истощится и жабры побелеют, прекратите перфузию PBS. Позже удалите иглы, фиксирующие тело рыбы на месте, и зафиксируйте рыбу брюшной стороной вниз. Перерезав спинной мозг и удалив череп из тектума зрительного нерва и головного мозга, перережьте зрительные нервы и рассеките головной мозг.
Затем переложите мозг в 1,5-миллилитровые пробирки с одним миллилитром 4% параформальдегида в PBS, чтобы зафиксировать на ночь при четырех градусах Цельсия. После промывания фиксированных мозгов три раза в PBS в течение пяти минут каждый, переложите мозги в 1,5-миллилитровые пробирки с одним миллилитром сахарозы 30% по объему в PBS в качестве криопротектора и инкубируйте их в течение ночи при четырех градусах Цельсия. Приготовьте смесь для заделки, смешав 30%-ную сахарозу с 30 миллилитрами смеси с оптимальной температурой резки или OCT, и храните смесь при четырех градусах Цельсия.
Чтобы один раз охладить криомолд, инкубируйте алюминиевый блок в течение ночи при температуре минус 80 градусов по Цельсию и поместите предварительно охлажденный блок в коробку из пенополистирола с крышкой, чтобы предотвратить нагрев. Для корональных срезов вставьте рассеченный мозг в криомолд, отрегулировав ориентацию с помощью щипцов под микроскопом. Затем поместите криомолд на предварительно охлажденный алюминиевый блок в коробке из пенополистирола и дайте составу OCT застыть и стать белым.
По мере замерзания соединения нанесите небольшой круг соединения ОКТ на диск образца перед установкой криоблока на диск образца. Поместив диск с образцом в криостат, заморозьте соединение ОКТ. Затем поместите диск с образцом на головку образца в криостате.
После установки ориентации криоблока обрежьте ОКТ, чтобы удалить все лишние области. Вырежьте серийные срезы толщиной 14 микрометров по всему оптическому тектуму с помощью криостата и храните предметные стекла при температуре минус 25 градусов по Цельсию. Оценивалась пролиферация радиальных глиальных клеток, или RGC, в ткани головного мозга рыбок данио.
Большинство RGC были пролиферирующими клеточными антигенами в контралатеральном неповрежденном полушарии. Через два дня после травмы пролиферация RGC была индуцирована на поврежденной стороне тектума медаки. После черепно-мозговой травмы клеточную линию и дифференцировку RGC оценивали с помощью маркировки бромдезоксиуридином или BrdU.
Репрезентативный анализ показывает новорожденные нейроны через семь дней после травмы у травмированных рыбок данио-рерио и медаки. Одним из важнейших шагов при ножевых ранениях является ручное введение иглы. Последовательная травма необходима для создания воспроизводимых результатов.
Флуоресцентные красители эффективны в качестве раневых маркеров. Степень диффузии флуоресцентного красителя указывает на локализацию и глубину ножевого ранения. Этот метод потенциально адаптирован к другим мелким видам рыб, а адаптация к медаке позволяет сравнивать регенеративную способность.
