Поэтому моя лаборатория заинтересована в понимании того, как глаз и мозг растут вместе. Этот метод позволяет нам изучить, как вход сетчатки влияет на рост и развитие мозга. Хирургическое удаление одного глаза у живой личинки рыбки данио с последующим наблюдением за оптическим тектумом позволяет сравнить иннервированные и денервированные тектальные доли внутри одного и того же животного и у разных животных.
Сочетание этой техники с современными молекулярными подходами может дать новое представление о механизмах, лежащих в основе нейронного развития, регенерации и дегенерации. Для начала подключите катодные и анодные провода к источнику питания. Прикрепите зажим аллигатора на конце катодной проволоки к частично выпрямленной скрепке и вставьте скрепку в раствор гидроксида калия, прикрепив ее к боковой части банки.
Прикрепите зажим аллигатора анодной проволоки к шейке игольчатого держателя. Поверните мощность примерно на 20 вольт и окуните вольфрамовую проволоку в раствор гидроксида калия, вытащив проволоку из раствора под углом, чтобы электролитически заточить проволоку в тонкий наконечник. Проверьте кончик иглы под рассекающим микроскопом, чтобы убедиться, что он достаточно острый.
Изогнутый кончик иглы возникает, когда острая игла сгибается, осторожно касаясь ее к чашке Петри. В день операции используйте стеклянную пастбищную пипетку с широким отверстием, чтобы перенести от 10 до 15 личинок в 35-миллиметровую чашку Петри, наполненную свежей E3. Добавьте три-пять капель анестетика к личинке. Чтобы определить, адекватно ли обезболены личинки, обратите внимание на отсутствие сенсорной реакции.
Добавьте еще две-три капли анестетика, если личинки все еще реагируют на прикосновения через три минуты и переоценивайте. Чтобы обездвижить личинку для операции, возьмите одну личинку в узкую стеклянную пастбищную пипетку с небольшим количеством E3. Затем возьмите примерно 200 микролитров расплавленной 1% низкой температуры плавления или агарозы LMP в пипетку, содержащую личинку, и перемешайте, чтобы убедиться, что личинка суспендирована в агарозе LMP. Поместите крышку 35-миллиметровой чашки Петри лицом вверх под рассекающий микроскоп, затем брызните личинку и агарозу на перевернутую крышку чашки Петри.
Распределите агарозу так, чтобы личинка оказалась в центре капли. Используя тусклую вольфрамовую иглу, быстро, но осторожно маневрируйте личинкой так, чтобы она была боковой с одним глазом, обращенным вверх. Подождите несколько минут, пока агароза установится.
Следуя краю глазной орбиты, используйте кончик тонкой электролитически заточенной вольфрамовой иглы, чтобы проткнуть кожу вокруг глаза. Затем сдвиньте край иглы под глаз с височно-вентральной стороны глаза. Используйте контролируемое давление, чтобы освободить глаз от глазницы.
Продолжайте давить на глаз дорсально и спереди боковой стороной иглы, в конечном итоге разрезая зрительный нерв и освобождая глаз. Кроме того, вы можете использовать очень тонкие хирургические щипцы для удаления глаза, защемляя зрительный нерв и подталкивая глаз от медиального к латеральному. После успешного удаления глаза накройте агарозу раствором MMR, освободите каждую личинку от агарозы, осторожно расчесывая вольфрамовую иглу вокруг головы, а затем по всему телу, стабилизируя крышку чашки Петри щипцами.
После операций поместите личинку в раствор MMR, дополненный антибиотиками, до следующего дня, затем верните личинку в E3 и выращивайте их до конечной точки эксперимента. После того, как личинки будут окончательно обезболены, зафиксируйте их 4% параформальдегидом. Подвешивайте неподвижные личинки в каплях PBS на защитной пластине под рассекающим микроскопом.
Закрепите их сбоку, поместив два вольфрамовых штифта через нотохорду с одним штифтом позади пигментированной области, покрывающей область AGM, и другим на одной линии с концом удлинения желтка. Удалите глаз острой вольфрамовой иглой и тонкими щипцами. Иногда удается просунуть иглу через челюсть в противоположную сторону и удалить другой глаз.
Используйте вольфрамовую иглу, чтобы поцарапать от височной до вентральной стороны уха. В том же действии в движении поднесите иглу сзади к челюсти и осторожно потяните кпереди, пока ухо и челюсть не будут удалены. Удалите другой глаз и ухо, просунув иглу через челюсть.
Используйте щипцы, чтобы вытащить вентральные органы и оставшийся желток. Наконец, сделайте неглубокий разрез в дорсальной черепной коже вблизи соединения между задним и спинным мозгом. Подтяните кожу щипцами и потяните ее спереди и вокруг теленцефалона.
Удалите оставшуюся ткань щипцами. Открепите личинку и переведите в PBS в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку. Закрепите камерный затвор в крышке 100-миллиметровой чашки Петри вакуумной смазкой.
Перенесите иммуноокрашенную и обработанную личинку на пластину лунки или углубление, чтобы просмотреть их с помощью рассекающего микроскопа. Установите личинку на камерную горку в 1%LMP агарозных колоннах. Используя стакан мимо пипетки, положите одну личинку на камерный слайд, нанеся как можно меньше PBS.
Накройте личинку расплавленной и теплой 1%-ной агарозой LMP с помощью той же пипетки. Пипетка LMP агароза в колонну, а затем позиционирует личинку как можно более симметрично с видимой дорсальной поверхностью. После удаления глаз прогрессирующая дегенерация аксонов сетчатки наблюдалась в оптической тектум нейропил.
К двум дням послеоперационной операции аксоны, помеченные RFP, демонстрировали признаки быстрой валлеровской дегенерации, такие как болтовня и фрагментация. RFP положительные пункты были отмечены как внутри, так и за пределами нейропила на правой стороне тектума, как указано стрелками. К четырем дням после операции фрагментированные аксоны и меченые RFP аксональные обломки были значительно уменьшены в правой тектальной доле, что указывает на относительно быстрый клиренс умирающих и дегенеративных аксонов.
Мозг подвергался воздействию путем рассечения глаз, челюсти, ушей и тюбетейки кожи и соединительных тканей. В идеале мозг остается нетронутым во время этой процедуры. Тем не менее, части переднего мозга, особенно обонятельная луковица, вероятно, были повреждены или полностью удалены, когда черепная крышка кожи или челюсти была удалена.
Более того, иногда боковой выступ тектума разрезается при прокалывании или защемлении кожи, чтобы вытащить ее из мозга. Нет двух одинаковых образцов. Таким образом, вы должны быть в состоянии сделать тонкие адаптации через удаление глаз и рассечение мозга по мере необходимости.
Пациенты и острые инструменты необходимы для успеха. Этот метод может сопровождаться клеточными и молекулярными подходами, такими как визуализация живых клеток in vivo или секвенирование РНК, чтобы получить новое представление о молекулярных и клеточных механизмах роста и развития оптических тектумов.
