Этот протокол демонстрирует кристаллизацию белка на чип-подобном устройстве при воспоминании данных рентгеновской дифракции. Это устройство называется кристаллом на кристалле, потому что кристаллы белка растут на кристалле одного кварца. При успешном росте кристаллов белка на таких устройствах с каждого устройства собираются тысячи дифракционных изображений при комнатной температуре, даже не касаясь кристаллов белка.
Рентгеновская дифракция при комнатной температуре очень важна для изучения функции белка, включающей многие конформационные состояния. Эти информативные изменения белка или белковые действия могут быть заморожены, поэтому не обнаруживаются в криокристаллографии. Эти устройства могут быть использованы для изучения световых сигнальных процессов и окислительно-восстановительных изменений.
Только несколько устройств предоставляют полные и избыточные наборы данных. Чтобы начать предварительную сборку устройства, наметьте внешнее кольцо для идентификации образца. Укажите имя проекта, номер устройства, условие кристаллизации и дату.
Затем поместите меченое кольцо вверх ногами на чистую поверхность и поместите одну кварцевую пластину внутрь наружного кольца. Затем налейте небольшое количество масла для погружения микроскопа в чашку Петри и окуните прокладку в масло, убедившись, что обе стороны прокладки хорошо покрыты. Удалите излишки масла, нанеся прокладку на чистую поверхность.
Затем поместите смазанную маслом прокладку поверх первой кварцевой пластины. Смешайте белковый раствор и буфер кристаллизации на первой кварцевой пластине с помощью пипетки. Старайтесь избегать пузырьков воздуха при смешивании.
Общий объем кристаллизационного раствора не должен превышать максимальную емкость кристаллизационной камеры, определяемую размером и толщиной прокладки. Поместите вторую кварцевую пластину поверх смешанного раствора. Раствор будет распространяться спонтанно.
Затем слегка постучите по краю второй кварцевой пластины, чтобы помочь намазать масло, выталкивая воздух. Закрепите устройство, вкрутив стопорное кольцо в наружное кольцо. При необходимости используйте затягивающий инструмент.
Избегайте чрезмерного затягивания, так как это может привести к деформации или растрескиванию тонких кварцевых пластин. Храните собранные устройства в коробке при комнатной температуре или в инкубаторе с контролируемой температурой. Через несколько часов или дней поместите кристаллизационное устройство под микроскоп и следите за ростом кристаллов.
При необходимости оптимизировать условия кристаллизации, как описано в рукописи. Для калибровки установите тонкий кристалл YAG на держатель микросхемы, затем установите упор луча. Затем откройте программное обеспечение Insitux и запустите указанную программу для получения рентгеновских флуоресцентных изображений прямого луча, где устройство представляет собой выбранное пользователем имя для устройства кристаллизации и устройства.
param — это имя файла, содержащее параметры управления для конкретного устройства. Затем найдите точное положение прямого рентгеновского пучка, запустив программу установки профиля луча, где изображение ожога является именем файла рентгеновского флуоресцентного изображения. Для оптического сканирования поместите кристаллизационное устройство в держатель чипа и закрепите его с помощью винта.
Затем установите держатель микросхемы на ступень трансляции дифрактометра через кинематический механизм. В зависимости от светочувствительности образца белка и цели эксперимента установите белый или инфракрасный источник света для получения микроснимков из оптического окна прибора. Как только настройка будет готова, запустите программу сканирования, введя указанную команду для сканирования в движении на линии луча.
Затем запустите программу разметки на компьютере пользователя, где x — начальное значение для столбца, а y — начальное значение для мошеннических перемещений микрофотографий. Программа сшивает все микроснимки в монтаж с разрешением от одного до трех микрометров. После сшивания микроснимков введите указанную команду для запуска программы поиска кристаллов.
Эта программа выполняет распознавание кристаллов и планирование выстрела, а ключевые параметры в этой программе позволяют выбирать кристаллы и планировать цели. Извлеките источник света и установите точку луча. Затем запустите программу сбора данных для последовательной дифракции.
Предлагаемая команда запускает сбор данных путем посещения запланированных снимков в заранее запрограммированной последовательности. Каждый целевой кристалл перемещается в положение пучка. На каждой остановке рентгеновское облучение проводится либо с лазерной подсветкой, либо без нее с запланированной временной задержкой.
В исследовании сравнивались условия кристаллизации между диффузией пара и партией на чипе. Здесь демонстрируются четыре тематических исследования кристаллизации на кристалле и репрезентативные наборы данных, собранные непосредственно с кварцевых устройств. Эксперименты динамической кристаллографии выявили световые изменения в дальнем красном фоторецепторном белке путем сравнения данных 4 352 кристаллов в темноте и 8 287 кристаллов после освещения света.
Темный набор данных из последовательной дифракции Лауэ in situ привел к лучшей разрешенной электронной плотности, что позволило уверенно построить модель билинового хромофора во всей конформации знака Z. Карты различий, индуцированные светом, выявили согласованные движения в центральном бета-листе, предполагающие важность укладки пи-пи между пиррольными кольцами хромофора и несколькими ароматическими остатками. Эта платформа называется Insitux.
Уникальное преимущество этой платформы заключается в том, что после кристаллизации не нужно делать никаких манипуляций с кристаллами. Необходимо собрать множество наборов данных в изменяющихся условиях, чтобы уловить движения белка. И это становится возможным с Insitux, потому что он позволяет крупномасштабно собирать данные из тысяч кристаллов белка при комнатной температуре.
С помощью этой новой возможности, включая кристаллографию, светочувствительные системы могут быть запущены внутри устройства, а светоинертная система может быть изучена, если кристаллическое устройство преобразуется в оттоки.
