Серийные эксперименты по кристаллографии могут быть сложными. Ключевым препятствием в их практике является создание микрокристаллических образцов. Этот протокол показывает, как можно надежно создавать такие образцы.
Этот метод использует эндотиапепсин для создания основы для оптимизации крупных кристаллов, выращенных в пластинах для диффузии пара малого объема, в микрокристаллические суспензии большого объема. Мы не можем утверждать, что этот протокол будет повсеместно успешным. Тем не менее, мы надеемся, что идеи и методы, предложенные здесь, дадут другим экспериментальную основу для использования на других белках.
Для начала подготовьте планшет с двумя каплями 96 лунок с кристаллизационным буфером с помощью робота Formulatrix. Используя смесь робота для обработки жидкостей, смешайте 150 нанолитров свежеразмороженного эндотиапепсина со 150 нанолитрами кристаллизационного буфера в каждой лунке. Запечатайте пластину и дайте кристаллам расти в течение 24 часов внутри отеля Formulatrix.
Через 24 часа разбейте и удалите кристаллы из пяти лунок 96-луночной кристаллизационной пластины. Поместите их в 250 микролитров кристаллизационного буфера в центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, помещенную в ведро со льдом. Добавьте от 10 до 15 стеклянных шариков размером в один миллиметр в пробирку центрифуги.
Вращайте кристаллы и бусины со скоростью 1000 об/мин в течение 30 секунд и заменяйте их на льду в течение 30 секунд. Затем семена можно сразу использовать или хранить при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Чтобы провести эксперимент с морфограммой, добавьте от пяти до 40% концентраций ПЭГ 6000 с одним молярным трис-HCl при рН семь и 0,15 моляра хлорида магния вдоль колонок пластин двухкапельного 96-луночного сетчатого экрана. Восстановите последовательное разведение эндотиапепсина в 0,1 молярном ацетате натрия от 100 до 12,5 миллиграммов на миллилитр в течение восьми шагов.
Затем пипеткой насыпьте восемь микролитров каждого разбавления, а затем два микролитра семенного материала в тарелку робота для обработки жидкости. Используя робота для обработки жидкостей, распределите 150 нанолитров каждого разбавления эндотиапепсина в первую и вторую подлунки экрана. Мультиаспирируйте 50 нанолитров размороженного семенного материала и 100 нанолитров луночного раствора из второй лунки и распределите оба в белковый раствор.
Смешайте растворы три раза после добавления кристаллизационного буфера или кристаллизационного буфера и смеси семян. Теперь запечатайте пластину и изображение в ноль, три, шесть, 12, 18 и 24 часа первого дня каждый день в течение первой недели и каждую неделю в течение следующих четырех недель при температуре 20 градусов по Цельсию. Через 24 часа посмотрите на пластину под микроскопом, оцените количество кристаллов в каждой лунке и измерьте образец кристаллов.
Запишите эти оценки в предоставленный лист генератора морфограмм. Введите начальные концентрации эндотиапепсина и ПЭГ 6000 в соответствующие поля. Рабочий лист автоматически отобразит результаты в традиционном формате фазовой диаграммы с осадителем и концентрацией белка по осям X и Y соответственно.
Условия колодца, которые дают начало кристаллам только в их засеянных каплях, указывают на метастабильную область диаграммы, тогда как условия с кристаллами как в засеянных, так и в незасеянных каплях указывают на зону зародышеобразования. На основе анализа морфограммы выберите наиболее перспективное условие для масштабирования на 24 скважины. Затем начните со 100 миллиграммов на миллилитр эндотиапепсина и 35% ПЭГ 6000.
Приготовьте пять миллилитров кристаллизационного буфера с 35% ПЭГ 6000, 0,1 молярного трис-HCl с рН семь и 0,15 молярного хлорида магния. Теперь поместите 0,5 миллилитра кристаллизационного буфера в три лунки смазанной маслом 24-луночной подвесной пластины. Смешайте 15 микролитров эндотиапепсина с 15 микролитрами кристаллизационного раствора на стеклянном покровном стекле.
Поместите раствор над лунками и оставьте тарелку на 24 часа. Через 24 часа посмотрите на пластину под микроскопом, оцените количество кристаллов в капле и измерьте их размер. Если кристаллы неверны, повторите этот шаг, но измените концентрацию белка или добавьте семена, если зарождение кристаллов недостаточно высокое.
Повторите эксперимент с 24-луночным масштабированием, добавив семена с более высокой концентрацией PEG 6000. Поместите 0,5 миллилитра нового кристаллизационного буфера в три лунки смазанной маслом 24-луночной подвесной пластины. Поместите 15 микролитров эндотиапепсина на стеклянное стекло и смешайте пять микролитров семенного материала и 10 микролитров кристаллизационного раствора с раствором эндотиапепсина.
Переверните покровные листы, поместите их над лунками и оставьте на 24 часа. Перепроверьте капли, чтобы убедиться, что кристаллы меньше и имеют ли они более высокую концентрацию. Оцените количество кристаллов в капле и снова измерьте их размер, чтобы увидеть, имеют ли они теперь правильный размер.
Для выполнения протокола затравки приготовьте кристаллизационный буфер из 40% PEG 6000, 0,1 молярного Tris-HCl с pH семь и 0,15 молярного хлорида магния. Предварительно смешайте 50 микролитров семенного материала и 100 микролитров кристаллизационного раствора и смешайте с белковым раствором в пробирке центрифуги объемом 1,5 миллилитра. Покрутите трубку в течение 10 секунд и поместите ее на коромысло или шейкер при температуре 20 градусов по Цельсию.
Принимайте аликвоту 2,5 микролитра порционного раствора каждые 20 минут. Следите за размером и количеством кристаллов с помощью гемоцитометра. Подсчитайте количество кристаллов и измерьте их размер под микроскопом.
Когда кристаллы достигнут размера около 15 микрон, погасите реакцию 150 микролитрами 0,5 молярного ацетата натрия, дополненного 0,5 молярным трис-HCl, 0,075 молярным хлоридом магния и 20% PEG 6000. Повторно проверьте размер и концентрацию кристаллов с помощью гемоцитометра. Храните кристаллы при температуре 20 градусов Цельсия.
Анализ морфограммы эндотиапепсина показал, что на зарождение влияют как концентрации белка, так и осадителя. Области MetaStable, зародышеобразования и осаждения на диаграмме можно хорошо различить. Добавление семян значительно увеличивало количество кристаллов по сравнению с каплями без семян.
Анализ микрокристаллизации эндотиапепсина в объемах от 200 до 300 микролитров выявил изменения в зародышеобразовании кристаллов и самое длинное измерение с течением времени. Увеличение концентрации ПЭГ до 35% заметно улучшило кристаллизацию, с конечной концентрацией кристаллов примерно в 3,6 раза от 10 до шести на миллилитр и самым длинным размером кристалла 42 микрометра. Чтобы уменьшить размер конечных кристаллов, был применен подход к снижению концентрации белка, который, к сожалению, значительно снизил концентрацию кристаллов и в конечном итоге привел к еще более крупным кристаллам.
Однако подход к увеличению концентрации ПЭГ до 40% дал кристаллы примерно в 3,1 раза от 10 до шести на миллилитр и размером примерно 39 микрометров. Кроме того, добавление семян привело к значительному увеличению концентрации кристаллов, примерно в 1,1 раза от 10 до восьми на миллилитр и меньшим размерам примерно на 4,2 микрометра. Эффект закалки, предпринятый в реакции кристаллизации, дал конечную концентрацию кристаллов примерно в 2,6 раза от 10 до шести на миллилитр и размер примерно 15 микрометров.
CC, наполовину построенный против разрешения рентгеновских данных, показал небольшое снижение разрешения кристаллов с 10 микролитров до 200-300 микролитровых объемов. Тем не менее, кристалл все еще дифрагировал до 1,5 angstrum, что считалось достаточным. Эндотиапепсин — это щадящий белок для работы.
Мы надеемся, что испытание этого протокола эндотиапепсина приведет к полезным идеям и методам для других белков. В частности, в кристаллографии полезно видеть, как все выглядит и ощущается, а не пытаться следовать только письменному протоколу. Мы надеемся, что это видео даст вам представление об этом.
