Мы предоставляем анализ одной молекулы для наблюдения за фазовым разделением факторов транскрипции на ДНК Этот метод позволяет в реальном времени реализовать динамический процесс сборки факторов транскрипции в виде жидкой капли на ДНК. EWS-FL1 является одним из наиболее часто участвующих генов слияния в опухолевом генезе саркомы Юинга. Наше исследование может выявить связь между числом мотивов ДНК и образованием конденсата EWS-FL1, который связан с бесплодной транскрипцией генов в опухолевых клетках и, возможно, полезен для прогноза.
Этот метод может быть применен для изучения любых транскрипционных конденсатов или комплексов in vitro, таких как P53 и MED1. Чтобы подготовить проточную ячейку с зигзагообразными наноконструкциями для эксперимента с ДНК-занавесом, подключите входную и выходную трубки в правильном направлении. Затем промыть проточную ячейку 2,5 миллилитрами липидного буфера с помощью двух трехмиллилитровных шприцев, убедившись, что в проточной ячейке нет пузырька.
Извлеките шприц с выхода и введите один миллилитр раствора липосом три раза с пятиминутной инкубацией между каждой инъекцией. Для заживления медленно промывайте проточную клетку 2,5 миллилитрами липидного буфера и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут. Во время инкубации подготовьте буфер BSA, как указано в текстовой рукописи.
Затем, после 30 минут заживления, промыть проточную ячейку 2,5 миллилитрами буфера BSA с выходной стороны. Затем вводят 800 микролитров буфера стрептавидина в проточную ячейку с входной стороны в два этапа с 10-минутной инкубацией после каждой стадии. Затем промыть проточную ячейку 2,5 миллилитрами буфера BSA, чтобы удалить все свободные молекулы стрептавидина.
Затем разбавьте биотин лямбда-ДНК клонированными мотивами с помощью буфера BSA и вводите его четыре раза медленно с пятиминутными интервалами. Во время инъекции включите микроскоп в научной дополнительной полупроводниковой системе оксида металла. Затем промыть трубку 10 миллилитрами двойной дистиллированной воды и промыть призму и соединитель трубки водой, 2% жидким очистителем кюветы и 99% этанолом.
Затем наберите не менее 20 миллилитров буфера визуализации в шприц объемом 30 миллилитров. Настройте проточную ячейку на ступень микроскопа и подключите ее к микрофлюидной системе. Используя скорость потока 0,03 миллилитра в минуту, смывайте молекулы ДНК к барьеру в течение 10 минут.
Затем выключите микрофлюидную систему и высиживайте в течение 30 минут. с прекращением потока, позволяя ДНК диффундировать латерально. Чтобы получить изображение конденсации EWS-FLI1 на завесах ДНК, откройте программное обеспечение для визуализации и найдите и отметьте положения девяти зигзагообразных узоров под ярким полем.
Затем включите поток со скоростью 0,2 миллилитра в минуту, чтобы окрасить ДНК двухцепочечным красителем ДНК в течение 10 минут. Далее разбавляют белок mCherry EWS-FLI1 буфером визуализации в концентрации 100 наномолей в 100 микролитрах. Затем загрузите образец белка через клапан со стеклянным шприцем 100 микролитра и измените скорость потока до 0,4 миллилитра в минуту.
После включения 488-нанометрового лазера предварительно сканируйте каждую область, чтобы проверить состояние распределения ДНК и выбрать область, в которой молекулы ДНК распределяются равномерно. Затем установите мощность лазера на 10% для 488-нанометрового лазера и 20% для 561-нанометрового лазера. А с помощью измерителя мощности измерьте реальную мощность лазера вблизи призмы.
Начните получать изображения с интервалом в две секунды с помощью 488 и 561 нанометровых лазеров одновременно. Затем переключите клапан с ручного режима на режим впрыска, чтобы буфер визуализации смывал образец белка в проточную клетку через 60 секунд. Чтобы удалить свободный EWS-FLI1, продолжайте промывать проточную ячейку буфером визуализации в течение пяти минут, включив только 561-нанометровый лазер.
Затем остановите течение и высиживайте при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут. Через 10 минут включите поток со скоростью 0,4 миллилитра в минуту, чтобы позволить ДНК расширяться и получать изображения с интервалом в две секунды между различными кадрами для получения данных о высокой пропускной способности образования конденсата EWS-FLI1. Молекулы EWS-FLI1 были визуализированы путем обнаружения сигналов EWS-FLI1, помеченных mCherry, полученных с помощью 561-нанометрового лазера.
Образование in vitro конденсата EWS-FLI1 в месте 25 повторов GGAA в субстрате ДНК может быть непосредственно визуализировано. Специфичность mCherry EWS-FLI1, используемого в ДНК-занавесках, была подтверждена электрофоретическим анализом сдвига подвижности с использованием шаблона ДНК с 25 повторами GGAA и без них отдельно. Когда концентрация EWS-FLI1 была титрована от 20 до 500 наномолей, интенсивность EWS-FLI1 резко возросла.
В то время как изменение интенсивности FLI на одну DBD было незначительным, когда белки были насыщены для покрытия повторов GGAA, предполагая, что EWS-FLI1 образовывал конденсаты на ДНК. Инъекция должна быть очень медленной и мягкой, чтобы липосомы и ДНК могли равномерно распределяться по проточной клетке. Важно выполнить MSA, чтобы подтвердить, что очищенный транскрипционный фактор специфически связывается с целевой последовательностью in vitro.
Этот метод позволяет людям исследовать, будет ли конденсат облегчать целевой поиск факторов транскрипции и его влияние на транскрипцию.
