EWS-FLI1凝聚物在DNA上组装的单分子成像

我们提供单分子测定来观察DNA上转录因子的相分离该技术允许实时实现转录因子组装为DNA上的液滴的动态过程。EWS-FL1是尤因肉瘤肿瘤发生中最常参与的融合基因之一。我们的研究可以确定DNA基序数与EWS-FL1凝聚物形成之间的关系，这与肿瘤细胞中贫瘠的基因转录有关，可能有助于预后。

该方法可用于体外研究任何转录缩合物或复合物，如P53和MED1。要制备具有锯齿形纳米制造屏障的流通池用于DNA幕实验，请以正确的方向连接输入管和输出管。然后使用两个三毫升注射器用2.5毫升脂质缓冲液清洗流通池，确保流通池中没有气泡。

从输出中取出注射器，注射一毫升脂质体溶液三次，每次注射之间孵育五分钟。为了愈合，用2.5毫升脂质缓冲液缓慢重新洗涤流通池，并在室温下孵育30分钟。在孵育过程中，按照文本手稿中所述制备BSA缓冲液。

然后在愈合30分钟后，从输出侧用2.5毫升BSA缓冲液洗涤流通池。接下来，分两步从输入侧将 800 μL 链霉亲和素缓冲液注入流通池中，每步后孵育 10 分钟。然后用2.5毫升BSA缓冲液洗涤流通池以去除所有游离链霉亲和素分子。

接下来，使用BSA缓冲液用克隆基序稀释生物素Lambda DNA，并以五分钟的间隔缓慢注射四次。在注射过程中，打开科学互补金属氧化物半导体系统中的显微镜。然后用10毫升双蒸水清洗管道，并用水，2%液体比色皿清洁剂和99%乙醇冲洗棱镜和管道连接器。

接下来，将至少20毫升的成像缓冲液吸入30毫升的注射器中。在显微镜载物台上设置流通池并将其连接到微流体系统。使用每分钟0.03毫升的流速，将DNA分子冲洗到屏障上10分钟。

然后关闭微流体系统并孵育30分钟。随着流动停止，允许DNA横向扩散。要对DNA幕上的EWS-FLI1凝聚形成进行成像，请打开成像软件，在明场下找到并标记九种锯齿形图案的位置。

然后以每分钟0.2毫升的速度打开流量，用双链DNA染料染色DNA10分钟。接下来，用成像缓冲液在 100 微升中以 100 纳摩尔的浓度稀释 mCherry EWS-FLI1 蛋白。然后用100微升玻璃注射器通过阀门加载蛋白质样品，并将流速更改为每分钟0.4毫升。

打开488纳米激光后，预扫描每个区域以检查DNA分布状态并选择DNA分子均匀分布的区域。然后将488纳米激光器的激光功率设置为10%，将561纳米激光器的激光功率设置为20%。并使用功率计，测量棱镜附近的实际激光功率。

开始以两秒的间隔同时使用488和561纳米激光器采集图像。然后将阀门从手动模式更改为进样模式，让成像缓冲液在60秒后将蛋白质样品冲洗到流通池中。要取出游离的 EWS-FLI1，请在仅打开 561 纳米激光器的情况下，继续用成像缓冲液清洗流通池五分钟。

然后停止流动并在 37 摄氏度下孵育 10 分钟。10分钟后，以每分钟0.4毫升的速度开启流动，让DNA在不同帧之间以两秒的间隔延伸和获取图像，以获得EWS-FLI1凝合物形成的高通量数据。通过检测用561纳米激光获得的mCherry标记的EWS-FLI1信号来可视化EWS-FLI1分子。

可以直接看到DNA底物中25个GGAA重复位点处EWS-FLI1缩合物的体外形成。DNA幕中使用的mCherry EWS-FLI1的特异性通过电泳迁移率位移测定得到证实，该测定使用分别具有和不具有25个GGAA重复序列的DNA模板。当EWS-FLI1浓度从20纳摩尔滴定到500纳摩尔时，EWS-FLI1强度急剧增加。

然而，当蛋白质饱和以覆盖GGAA重复序列时，FLI一DBD强度的变化可以忽略不计，这表明EWS-FLI1在DNA上形成缩合物。注射应该非常缓慢和柔软，以便脂质体和DNA可以均匀地分布在流通池上。重要的是进行MSA以确认纯化的转录因子在体外与靶序列特异性结合。

这种技术使人们能够探索凝聚物是否会促进转录因子的靶标搜索，以及它对转录的影响。