Этот протокол облегчает успешное определение структуры обязательной области NEMO IKK в ее несвязавом виде. И подробности его производства и кристаллизации. Протокол, использует эту стабилизацию родного подтверждения обязательного фрагмента домена IKK NEMO, через катушки катушки адаптеры, которые облегчают кристаллизацию и определение структуры.
Структурная биология NEMO, как мишень, обеспечивает важное преимущество в развитии ингибиторов NEMO для лечения воспалительных и аутоиммунных заболеваний и рака. Этот протокол может быть распространен на определение структуры комплексов NEMO, с пептидными или небольшими ингибиторами молекул для обнаружения или оптимизации лекарств. Рефолдирование и концентрация белка на этапе производства белка имеют основополагающее значение для получения чистого димера NEMO.
Ограничение агрегации и обеспечение солуства в условиях кристаллизации. Демонстрацией процедур будут Тамар и Эми, аспиранты нашей лаборатории. Начните с добавления 20 миллилитров потрясающего раствора бульона.
И 20 микролитров 100 миллиграмма на миллилитр стокового раствора ампициллина. К колбе 125 миллилитров Эрленмайера. Затем несколько микролитров запасов глицерола клеток, от 80 градусов по Цельсию хранения, BL21DE3 компетентных клеток.
Преобразовано с вектором. После встряхивания стартер культуры на ночь, при 37 градусов по Цельсию и 220 вращений в минуту, разбавить клетки OD600 из 0,1 и 250 миллилитров потрясающий бульон. И добавить ампициллин к окончательной концентрации 100 микрограмм на миллилитр.
Когда OD600 культуры достигает 0,8 к 1, добавьте IPTG к культуре, к концентрации 500 микромолеров. И расти клетки в течение четырех часов, при 37 градусов по Цельсию, пока OD600 достигает 6 до 10. В конце инкубации осадок клеток центрифугации.
И повторно приостановить гранулы в 40 миллилитров буфера лиза. Разделите повторно приостановленные ячейки на две алициты от 20 до 25 миллилитров. И используйте французскую прессу, чтобы применить около 25 000 фунтов на квадратный дюйм давления на клетки, два-три раза на алицит, в холодной комнате.
Затем добавьте мочевину в лисаты клетки, к конечной концентрации восьми молар. И инкубировать клеточный раствор на качалке платформы в течение двух-шести часов, при комнатной температуре. На следующее утро перенесите лисаты в ультра-центрифуговые трубки, по крайней мере, до трех четвертей на одну трубку.
И улрта центрифуга лисаты, в течение 45 минут. Декант supernatants в 50 миллилитров конической трубки. И загрузите инкубированный супернатант мочевины на столбец IMAC, со счетом 3 миллилитров в минуту.
Когда весь супернатант проехав через столбец, вымойте столбец на 10 томов столбца, с связывающим буфером, по три миллилитров в минуту. И выполнить градиент elution белка NEMO-EEAA от 10 до 500 миллимолейных имидазолов, в течение 12 градиента объема столбца. Сбор одного миллилитра aliquots eluate, в пластину сбора фракций.
После анализа страницы SDS, потяните фракции, содержащие чистый целевой белок и измерить концентрацию белка Брэдфорд анализа, в соответствии со стандартным протоколом. Выберите ускользаемые фракции, содержащие белок. Чтобы расщепить тег HIS6 и удалить избыток имидазола из образца, добавьте протеазу TEV, при соотношении веса от одного до 10, расщепленного белка TEV, в образец целевого белка.
И расширить образец на ночь в четырех литрах 20 миллимолейных Трис. 150 миллимолярд хлорида натрия и два миллимолярского раствора DTT. На следующее утро загрузите образец NEMO-EEAA на вторую колонку IMAC со счетом 1 миллилитр в минуту.
Сбор потока через в один миллилитр фракций, в 96 чаши фракции сбора пластины. Вымойте колонку пятью томами 20 миллимолярной трис, 150 миллимолярный хлорид натрия и 10 миллимолярный раствор имидазола, на один миллилитр в минуту. После последней стирки, elute TEV и uncleaved HIS6 NEMO-EEAA, с тремя томами колонки 20 миллимолярной Трис, 150 миллимолярный хлорид натрия, 500 миллимолярный имидазол и два миллимолярной DTT решение, в 50 миллилитровую колбу.
Потяните поток через фракции, содержащие расщепленную конструкцию NEMO-EEAA и сконцентрировать образец с концентратором перемешивают клетки, до пяти миллилитров. После ночного диализа, как было продемонстрировано, загрузите пять миллилитров образца на 16 миллиметров на 60 сантиметров размером с хроматографические столбцы. Повторение по мере необходимости, в зависимости от объема выборки.
На один миллилитр в минуту, и на два миллимолярные три, 100 миллимолярный хлорид натрия и два миллимолярных раствора ДДТ. Потянув фракции, соответствующие димерик NEMO-EEAA, концентрируют образец в концентраторе перемешиваемой клетки, с молекулярным весом, отрезанным мембраной в три килодалтона, до конечной концентрации 113 микромолей. Затем, aliquot белка для хранения при четырех градусах по Цельсию, на срок до одного месяца.
Для разреженного матричного скрининга добавьте 60 микролитров разреженного матричного раствора в каждую из 96 скважин из двух капельной камеры кристаллизации пластины. Для сидеть и падение пара диффузии. И добавьте белковый раствор в роботизированный капельный сеттер.
Далее используйте роботизированный капельный сеттер, чтобы распределить 100 нанолитров белкового раствора на 1,65 миллиграмма на миллилитр, в соотношении один к одному с раствором резервуара в капле один, до конечного объема 200 нанолитров. И добавьте 66 нанолитров белкового раствора со 134 нанолитров раствора резервуара, к окончательному объему 200 нанолитров в капле два. Затем немедленно запечатать пластину с трех дюймов широкой запечатывания ленты.
Затем храните лотки в хранилище изображений кристаллизации при 20 градусах по Цельсию. Проверка изображений, собранных автоматически, на наличие кристаллов, начиная через два дня после хранения пластин. Для генерации семян, передать всю каплю, содержащую кристалл интереса, в 50 микролитров кристаллизации состояние раствора, в предоставленном флаконе, из комплекта поколения семян.
И вихрь семенного запаса, с 20 секунд пульсации и 10 секунд отдыха, в течение трех минут. Затем, последовательно разбавить семенной запас, в один-пять шагом, вплоть до одного до 10000. И хранить разбавления при четырех градусах по Цельсию, до дальнейшего использования.
За один-два дня до отгрузки синхротрона, вырезать ленту из верхней части хорошо, с кристаллом интереса. И добавьте 0,5 микролитров раствора кристаллизации, содержащего 12%, два пропана ДиО криопротектор, непосредственно к колодец. Аккуратно выбить кристалл с крио петли.
Петля кристалла из хорошо, и хранить кристалл, содержащий крио петли в шайбу погружается в жидкий азот, до отгрузки для рентгеновского дифракции. После получения рентгеновских данных дифракции обработать масштабируемые интенсивности на сервере STAR и ISO. Использование рентгеновской кристаллографии индексации отрезал среднее, 1,2 для дифракции предел поверхности для данных.
И загрузите Феникс. Чтобы определить структуру, используйте рентгеновую структуру GCN4 в качестве модели поиска молекулярной замены, используя MRage в Фениксе. Структура 4DMD, будет определена как ансамбль.
И решение MRage будет успешно строить на структуру часть, соответствующая конечной терминал спиральный катушки адаптер NEMO-EEAA. к модели поиска, для обеих цепей в димере. Более выраженный белок появляется в полосе, примерно на 14 килодальтон молекулярном маркере веса, до первой очистки колонки IMAC.
И отображает мономерную полосу и более уменьшение полосы, на 14 и 28 килодалтонов, соответственно, после первого elution. Расщепление TEV практически завершено, следуя за элюционом, через вторую колонку IMAC. Почти полностью как димер, при ожидаемом молекулярном весе.
Размер исключение хроматографии, отображает один пик, ускользая от 60 до 65 миллилитров, которые реагируют на димер. Тонкий скрининг производит кристаллы, которые могут быть использованы для производства семенного запаса для производства кристаллов NEMO-EEAA, для сбора данных. Здесь показаны репрезентативные профили дифракции кристаллов NEMO-EEAA.
Структурный анализ белка NEMO-EEAA, показывает гомодимерные нерегулярные параллельные спиральные катушки, примерно 175 ангстремов в длину. Регулярная область спиральной катушки, включает в себя идеальную последовательность адаптера спиральной катушки, в конце срока. И первые два гептада надлежащей последовательности NEMO.
Регулярные спиральный катушки, также присутствует на C терминуса. Начиная с остатка NEMO 97 и охватывая терминал C идеальный катушки катушки адаптер. Бета-структура IKK, отображает более открытое подтверждение спиральной катушки, для размещения лиганда.
С большим межгелийский интервал от одного до 2,2 ангстремов в этом регионе. Структура лиганда в NEMO, предлагает новую цель для разработки ингибиторов с помощью вычислительных методов. И для визуального скрининга связывающих карманов с небольшими молекулами библиотек.
Теперь у нас есть путь для кристаллизации спроектированной конструкции NEMO в комплексе с небольшими лигандами молекул. Помочь в разработке и оптимизации нового класса ингибиторов.
