يمكن أن تكون تجارب علم البلورات التسلسلي صعبة. العقبة الرئيسية في ممارستهم هي إنشاء عينات الجريزوفولفين. يوضح هذا البروتوكول كيف يمكن إنشاء هذه العينات بشكل موثوق.
تستخدم هذه الطريقة endothiapepsin لإعطاء إطار لتحسين البلورات الكبيرة المزروعة في ألواح انتشار البخار صغيرة الحجم إلى ملاط الجريزوفولفين كبير الحجم. لا يمكننا الادعاء بأن هذا البروتوكول سيكون ناجحا عالميا. ومع ذلك ، نأمل أن الأفكار والأساليب المقترحة هنا تعطي الآخرين إطارا تجريبيا لتوظيفه على البروتينات الأخرى.
للبدء ، قم بإعداد صفيحة بئر 96 قطرتين باستخدام مخزن التبلور باستخدام روبوت Formulatrix. باستخدام مزيج روبوت مناولة السوائل ، امزج 150 نانولترا من إندوثيابسين المذاب حديثا مع 150 نانولترا من مخزن التبلور في كل بئر. أغلق اللوحة واترك البلورات تنمو لمدة 24 ساعة داخل فندق Formulatrix.
بعد 24 ساعة ، قم بتفتيت وإزالة البلورات من خمسة آبار من لوحة التبلور المكونة من 96 بئرا. ضعها في 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتبلور في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر يوضع في دلو ثلج. أضف 10 إلى 15 حبة زجاجية بحجم ملليمتر واحد في أنبوب الطرد المركزي.
دوامة البلورات والخرز عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية ، واستبدالها على الجليد لمدة 30 ثانية. يمكن بعد ذلك استخدام البذور على الفور أو تخزينها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. لإجراء تجربة مورفوجرام ، أضف خمسة إلى 40٪ تركيزات من PEG 6000 مع ضرس واحد Tris-HCl عند الرقم الهيدروجيني سبعة و 0.15 مولار كلوريد المغنيسيوم على طول أعمدة اللوحة لشاشة شبكية ذات قطرتين 96 بئرا إصلاح التخفيف المتسلسل للإندوثيابسين في 0.1 أسيتات الصوديوم المولية من 100 إلى 12.5 ملليغرام لكل ملليلتر على ثماني خطوات.
ثم ماصة ثمانية ميكرولتر من كل تخفيف متبوعا باثنين ميكرولتر من مخزون البذور في لوحة روبوت مناولة السوائل. باستخدام روبوت مناولة السوائل ، قم بتوزيع 150 نانولترا من كل تخفيف للإندوثيابسين في الآبار الفرعية الأولى والثانية من الشاشة. متعدد الشفط 50 نانولترا من مخزون البذور المذابة و 100 نانولتر من محلول البئر من البئر الفرعي الثاني ووزع كلاهما في محلول البروتين.
امزج المحاليل ثلاث مرات عند إضافة محلول التبلور أو محلول التبلور ومزيج البذور. الآن أغلق اللوحة والصورة عند صفر وثلاث وست و 12 و 18 و 24 ساعة من اليوم الأول كل يوم للأسبوع الأول وكل أسبوع للأسابيع الأربعة التالية عند 20 درجة سلزية. بعد 24 ساعة ، انظر إلى اللوحة تحت المجهر ، وقم بتقدير عدد البلورات داخل كل بئر وقياس عينة من البلورات.
سجل هذه التقديرات في ورقة عمل مولد مورفوجرام المقدمة. أدخل تركيزات البداية من endothiapepsin و PEG 6000 في الصناديق المناسبة. ستقوم ورقة العمل تلقائيا برسم النتائج بتنسيق مخطط الطور التقليدي مع تركيزات المرسب والبروتين على المحور X و Y على التوالي.
تشير ظروف البئر التي تؤدي فقط إلى ظهور بلورات في قطراتها المصنفة إلى منطقة MetaStable في الرسم البياني ، في حين أن الظروف مع البلورات في كل من القطرات المصنفة وغير المصنفة تشير إلى منطقة النواة. من تحليل المورفوغرام ، حدد الشرط الواعد للتوسع إلى 24 لوحة بئر. ثم ابدأ ب 100 ملليغرام لكل ملليلتر من إندوثيابسين و 35٪ PEG 6000.
تحضير خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت للتبلور مع 35٪ PEG 6000 ، 0.1 مولار Tris-HCl مع الرقم الهيدروجيني سبعة ، و 0.15 كلوريد المغنيسيوم المولي. الآن ضع 0.5 ملليلتر من المخزن المؤقت للتبلور في ثلاثة آبار من لوحة إسقاط معلقة مدهونة ب 24 بئرا. امزج 15 ميكرولترا من الإندوثيابسين مع 15 ميكرولترا من محلول التبلور على زلة غطاء زجاجي.
ضع المحلول فوق الآبار واترك الطبق لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة ، انظر إلى اللوحة تحت المجهر ، وقم بتقدير عدد البلورات في القطرة ، وقياس حجمها. إذا كانت البلورات غير صحيحة ، كرر هذه الخطوة ، ولكن قم بتغيير تركيز البروتين أو أضف البذور إذا لم تكن نواة البلورة عالية بما يكفي.
كرر تجربة تحجيم 24 بئرا عن طريق إضافة البذور بتركيز أعلى من PEG 6000. ضع 0.5 ملليلتر من مخزن التبلور الجديد في ثلاثة آبار من صفيحة معلقة مدهونة ب 24 بئرا. ضع 15 ميكرولترا من إندوثيابسين على غطاء زجاجي واخلط خمسة ميكرولترات من مخزون البذور و 10 ميكرولترات من محلول التبلور مع محلول إندوثيابيبسين.
اقلب زلات الغطاء ، وضعها فوق الآبار ، واتركها لمدة 24 ساعة. أعد فحص القطرات لمعرفة ما إذا كانت البلورات أصغر حجما ولها تركيز أعلى. قم بتقدير عدد البلورات في القطرة وقياس حجمها مرة أخرى لمعرفة ما إذا كانت الآن بالحجم الصحيح.
لتنفيذ بروتوكول دفعة البذور ، قم بإعداد المخزن المؤقت للتبلور بنسبة 40٪ PEG 6000 ، و 0.1 مولار Tris-HCl مع درجة حموضة سبعة ، و 0.15 مولار كلوريد المغنيسيوم. امزج مسبقا 50 ميكرولترا من مخزون البذور و 100 ميكرولتر من محلول التبلور ، واخلطه بمحلول البروتين في أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر. دوامة الأنبوب لمدة 10 ثوان ووضعه على الروك أو شاكر عند 20 درجة مئوية.
خذ حصصة 2.5 ميكرولتر من محلول الدفعات كل 20 دقيقة. مراقبة حجم وعدد البلورات باستخدام مقياس الدم. احسب عدد البلورات وقياس حجمها تحت المجهر.
عندما تصل البلورات إلى حوالي 15 ميكرون ، قم بإخماد التفاعل ب 150 ميكرولتر من 0.5 مولار أسيتات الصوديوم المكملة ب 0.5 مولار Tris-HCl و 0.075 مولار كلوريد المغنيسيوم و 20٪ PEG 6000. أعد فحص حجم البلورة وتركيزها باستخدام مقياس الدم. قم بتخزين البلورات على حرارة 20 درجة مئوية.
اقترح تحليل مورفوغرام الإندوثيابسين أن النواة تأثرت بكل من تركيزات البروتين والراسب. يمكن تمييز مناطق MetaStable و nucleation و Precipitation في الرسم البياني بشكل جيد. أدت إضافة البذور إلى زيادة كبيرة في عدد البلورات مقارنة بالقطرات بدون بذور.
كشف تحليل التبلور الدقيق للإندوثيابسين في أحجام 200 إلى 300 ميكرولتر عن التغيرات في نواة البلورة وأطول بعد بمرور الوقت. زيادة تركيز PEG إلى 35٪ تحسن بشكل ملحوظ في التبلور ، مع تركيز بلوري نهائي يبلغ حوالي 3.6 مرات 10 إلى ستة لكل مليلتر ، وأطول بعد بلوري يبلغ 42 ميكرومتر. لتقليل حجم البلورات النهائية ، تم تطبيق نهج تقليل تركيز البروتين ، مما أدى للأسف إلى تقليل تركيز البلورات بشكل كبير ، وفي النهاية أنتج بلورات أكبر.
ومع ذلك ، فإن نهج زيادة تركيز PEG إلى 40٪ أسفر عن بلورات حوالي 3.1 مرات 10 إلى ستة لكل مليلتر وحجم حوالي 39 ميكرومتر. علاوة على ذلك ، أدت إضافة البذور إلى زيادة كبيرة في تركيز البلورات ، حوالي 1.1 مرة 10 إلى ثمانية لكل ملليلتر وأبعاد أصغر تبلغ حوالي 4.2 ميكرومتر. أعطى تأثير التبريد الذي تمت محاولته في تفاعل التبلور تركيزا بلوريا نهائيا يبلغ حوالي 2.6 في 10 إلى ستة لكل مليلتر وحجم حوالي 15 ميكرومتر.
أظهر نصف CC المرسومة مقابل الدقة من بيانات الأشعة السينية انخفاضا طفيفا في الدقة البلورية من أحجام 10 ميكرولتر إلى 200 إلى 300 ميكرولتر. ومع ذلك ، لا تزال البلورة تنحرف إلى 1.5 قلق ، وهو ما اعتبر كافيا. Endothiapepsin هو بروتين متسامح للعمل معه.
نأمل أن تؤدي تجربة بروتوكول endothiapepsin هذا إلى توليد أفكار وطرق مفيدة للبروتينات الأخرى. خاصة مع علم البلورات ، من المفيد أن نرى كيف تبدو الأشياء وتشعر بها بدلا من محاولة اتباع بروتوكول مكتوب فقط. نأمل أن يمنحك هذا الفيديو بعضا من هذا الشعور.
