Questo protocollo combina l'ibridazione in situ dell'RNAscope a fluorescenza e l'immunoistochimica utilizzando preparati cerebrali freschi o fissi. Questa tecnica consente flessibilità dimostrando una combinazione di metodi di ibridazione in situ altamente sensibili e immunoistochimica per la visualizzazione spaziale di bersagli di RNA e proteine nello stesso campione di tessuto. Questo metodo è applicabile per la marcatura multiplex nella sezione del tessuto cerebrale, aiutando lo studio dell'organizzazione spaziale e del significato funzionale dell'mRNA e delle proteine all'interno di popolazioni neuronali eterogenee nelle neuroscienze.
Questo protocollo si concentra principalmente sulle fasi di lavorazione del tessuto fresco congelato e del tessuto fissato con paraformaldeide. Per iniziare a sezionare il tessuto cerebrale appena congelato, fissarlo al mandrino del criostato pre-raffreddato e tagliare sezioni coronali spesse 14 micrometri. Montare la sezione su un vetrino per microscopia caricato.
Trasferire il vetrino montato in una scatola per vetrini. Quindi trasportare la scatola nel congelatore a meno 80 gradi Celsius su ghiaccio secco. Per la fissazione dei tessuti, filtrare la soluzione di paraformaldeide preparata.
Raffreddare a 4 gradi Celsius. Portare il vetrino montato dal congelatore a meno 80 gradi Celsius su ghiaccio secco e immergerlo immediatamente nella soluzione di paraformaldeide pre-raffreddata per 15 minuti, eseguire la disidratazione del tessuto fresco-congelato per garantire che il vetrino sia completamente asciutto. Dopo aver rimosso il cervello da un supporto fisso a profusione transcardica, utilizzando un microtomo vibrante, tagliare sezioni di tessuto spesse 30 micrometri.
Conservare le sezioni tagliate in una soluzione crioprotettiva. Il giorno del test FISH, trasferire la sezione flottante in una piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti contenente PBS molare da 0,1 e agitarla a 90-100 giri/min su un agitatore a piattaforma rotante per lavare via il crioprotettore. Quindi, utilizzando un pennello, montare la sezione in piano su un vetrino per microscopia per evitare che si stacchi durante i lavaggi e asciugare all'aria per almeno due ore.
Utilizzando una penna barriera idrofoba, disegnare una barriera idrofobica attorno alla sezione per contenere i reagenti FISH. Dopo la pre-lavorazione, il tessuto viene incubato in soluzione di proteasi e ibridato con sonde RNAscope per due ore secondo le linee guida del produttore. Successivamente, vengono eseguite le fasi di amplificazione sequenziale e l'immunoistochimica a fluorescenza.
Iniziare preparando una camera umidificata protetta dalla luce per l'incubazione dei vetrini. A bagnomaria, riscaldare il tampone di lavaggio 50X e sonde a 40 gradi Celsius per 10 minuti. Una volta raffreddato a temperatura ambiente, preparare un litro di tampone di lavaggio 1X dalla concentrazione di 50X.
Preparare la miscela della sonda come descritto nel manoscritto del testo. Per il trattamento con proteinasi, aggiungere proteinasi 3 alla sezione di tessuto e incubarla a temperatura ambiente per 30 minuti. Per lavare via la proteinasi, immergere delicatamente il vetrino in PBS 0,1 molare a temperatura ambiente, evitando lo spostamento della sezione.
Per l'ibridazione, aggiungere la miscela della sonda alla sezione del tessuto. Metterlo nella camera umidificata preriscaldata. Quindi incubarlo per due ore a 40 gradi Celsius.
Sciacquare la sezione di tessuto con tampone di lavaggio due volte per due minuti. Per l'amplificazione del segnale, utilizzando un flacone contagocce, aggiungere una soluzione di amplificazione per coprire la sezione tissutale e incubare come descritto nel testo. Aggiungere la soluzione bloccante alla sezione di tessuto e incubare per un'ora a temperatura ambiente per evitare legami non specifici.
Muovere il vetrino per rimuovere il tampone bloccante in eccesso dopo l'incubazione. Ora, incubare la sezione con anticorpi primari per una notte a 4 gradi Celsius. Il giorno successivo, lavare il vetrino tre volte con 1X TBS.
Aggiungere l'anticorpo secondario e incubare le sezioni per due ore a temperatura ambiente. Esaminare il vetrino con un microscopio a epifluorescenza dotato di telecamera. Acquisisci immagini rappresentative con un ingrandimento di 20 volte e salvale come file TIF.
Nel presente studio, la qualità del tessuto, l'integrità e l'assenza di contaminazione batterica sono state confermate dall'assenza di etichettatura DAPI. La marcatura delle sonde di controllo positivo che hanno come bersaglio l'ubiquitina C, la peptidilprolil isomerasi B e l'mRNA della RNA polimerasi IIA hanno confermato l'integrità dell'RNA. Nelle preparazioni fresche congelate per distinguere i neuroni positivi all'mRNA GalR1 all'interno dell'NTS, sono stati utilizzati ulteriori marcatori neurochimici.
Il trasportatore vescicolare legato alla membrana è stato chiaramente etichettato. Al contrario, le proteine citoplasmatiche come la tirosina idrossilasi e la GFP espresse sotto il controllo del promotore PHOX2B sono state debolmente osservate e descritte come flocculanti in quanto prive di un contorno chiaro. La marcatura dell'mRNA citoplasmatico di GalR1 con sonda FISH GalR1 è stata punteggiata e osservata chiaramente.
Per confermare che la qualità dell'immunoistochimica dipende dalla localizzazione subcellulare delle proteine, diverse proteine nucleari e citoplasmatiche sono state marcate in parallelo con FISH nelle stesse sezioni di tessuto. La GFP citoplasmatica PHOX2B aveva un aspetto flocculante. Mentre il segnale della proteina nucleare PHOX2B era chiaro, il che ha confermato un'immunomarcatura di qualità superiore quando combinata con FISH.
Quando è stata eseguita su sezioni fisse congelate in combinazione con FISH, l'immunoistochimica si è dimostrata affidabile indipendentemente dalla localizzazione subcellulare. I neuroni positivi all'mRNA GlyT2 erano localizzati ventralmente all'NTS e non all'interno dell'NTS. I neuroni positivi all'mRNA GlyT2 e positivi all'mRNA PHOX2B non si sono colocalizzati.
Una sottopopolazione di neuroni NTS positivi all'mRNA PHOX2B era immunoreattiva della tirosina idrossilasi e nessuno conteneva mRNA GlyT2. RNAscope consente la visualizzazione e l'analisi della distribuzione dell'RNA alla risoluzione di una singola molecola nelle cellule e nei tessuti. Potenzia la ricerca su nuove specie di RNA, meccanismi di malattia, modelli di espressione genica, diversità dei neuroni e interazioni cellulari.
