Этот протокол имеет важное значение, поскольку он позволяет нокдаун и чрезмерное выражение генов в развивающихся рыб, и количественной оценки этих вниз по течению воздействие на клетки крови. Этот протокол является быстрым, простым в работе, экономичным и простым в автоматизации с доступом к надлежащему инструментарию. Демонстрация этой процедуры будет Кристен Rueb, студент исследователь в лаборатории.
Начните с переноса от пяти до 200, 48 часов после оплодотворения эмбрионов в пластиковые 10 сантиметров Петри блюдо. Наклоните блюдо так эмбриона опускаться до нижнего края, и удалить как можно больше E3 среды из блюда, как это возможно. Затем добавьте 500 микролитров протеазы деторионации к эмбрионам.
После пяти минут при комнатной температуре, наконечник всех эмбрионов на нижний край пластины снова и осторожно нажмите сторону блюда, что позволяет эмбрионам аккуратно руб против нижней части пластины, чтобы полностью удалить их хорионов. Использование выжать бутылку добавить около 20 миллилитров E3 среды, чтобы разбавить протеазы, и позволяют эмбрионам осесть. Затем декант среды, и промыть эмбрионы еще три раза со свежей среде, как только что продемонстрировали, чтобы удалить все следы протеазы.
Чтобы подготовить эмбрионы к диссоциации, используйте трубу P1000 для переноса от пяти до 10 эмбрионов в одну, 1,5 миллилитровую микро центрифугу и аспирировать перенесенную среду E3. Затем добавьте один миллилитр 10 миллимолярной DTT в E3 среды эмбриональной зебры, и поместите микроцентрифуг трубки в горизонтальном положении в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы удалить слизистое покрытие. Для диссоциации эмбрионов, мыть DTT лечение эмбрионов три раза с одним миллилитр DPBS дополняется кальцием и магнием на стирку.
Перед добавлением 500 микролитров DPBS, дополненных кальцием и магнием, и пять микролитров по пять миллиграммов на миллилитр, диссоциации протеазы. Затем инкубировать образцы при 37 градусах по Цельсию на горизонтальном орбитальном шейкере при 185 оборотов в минуту в течение 60 минут. Будьте уверены, чтобы периодически проверять эмбрионы, так что вы не более переварить их.
Когда не совсем однородный образец с некоторыми твердых тканей настоящее время можно наблюдать, тритурировать эмбрионы с P1000 пипетки до образца полностью разобщены. Чтобы подготовить диссоциированные эмбриональные клетки зебры для цитометрии потока, перенесите весь образец клетки на верхний резервуар пятими миллилитров полистирола круглой нижней трубки, с 35 микрометровым клеточным ситечком крышки. Промыть крышку четырьмя миллилитров PBS без кальция или магния, и гранулы клеток центрифугации.
Затем повторное потребление клеток в 500 микролитров PBS без кальция и магния на трубку. Для цитометрического анализа потока эмбриональных клеток зебры, осторожно вихрем клеточных суспензий, прежде чем добавить от одной до одной тысячи разбавления красного пятна мертвых клеток в каждой трубке. В течение 30 минут после нанесения пятна мертвой клетки, опорожнить резервуар для отходов, заполнить оболочку бак с соответствующим раствором, и начать жидкостную систему потока цитометра.
В программном обеспечении анализа нарисуйте пять участков и установите первый сюжет для измерения вперед и бокового рассеяния. Установите вперед рассеяния к линейной, и боковой рассеяния для logarithmic. Установите второй участок для измерения высоты рассеяния вперед по сравнению с шириной рассеяния вперед, а третий участок для измерения высоты рассеяния по сравнению с шириной бокового рассеяния.
Установите четвертый участок для измерения красного пятна мертвых клеток на х-оси, и боковой рассеяния по оси, чтобы дискриминация жить из мертвых клеток. Пятый участок должен быть установлен для измерения флюорофора выбора. Когда все участки будут установлены, загрузите образец на цитометр и уменьшите скорость потока, чтобы клетки не закончились быстро.
Отрегулируйте настройки перемотки вперед и сбоку так, чтобы основная часть популяции клеток была четко замечена, и нарисуйте ворота вокруг популяции клеток. Наклеить этикетку на эти ячейки ворот. Со второй точкой участок закрыты на клетки, ворота на вперед рассеяния и боковой рассеяния синглетов, чтобы исключить дублеты.
На четвертом участке отрегулируйте настройки пятна красных мертвых клеток так, чтобы была явно отрицательная популяция. Нарисуйте ворота вокруг этих ячеек и обозначить эти ворота живыми клетками. В пятом участке, ворота на живых клетках и нарисовать ворота вокруг положительных клеток, а затем запустить каждый образец сбора по крайней мере 25000 живых событий ячейки.
Когда все образцы были проанализированы, следуйте процедуре выключения, чтобы выключить жидкость, пополнить оболочку бака и опорожнить резервуар для отходов. После анализа процент GFP положительных красных кровяных телец из каждого эмбрионального образца зебры, в среднем все контрольной группы могут быть рассчитаны. Как правило, среднее значение устанавливается как один, и все проценты рассчитываются с этой точки отсчета.
В этом репрезентативном анализе было установлено, что уменьшение ISM1 стенограммы с конкретным морфолино, уменьшить количество GFP положительных красных кровяных телец, присутствующих в течение 48 часов после оплодотворения эмбрионов. Спасая это снижение уровня морфолино ISM1 с экзогенной мРНК, вернуть количество красных кровяных телец в нормальное русло. Правильное пищеварение на образцах имеет решающее значение.
Если вы перевариваете или перевариваете, вы не получите правильных результатов. Если факс доступен, исследователи могут собирать клетки крови путем сортировки для культуры in vitro, секвенирования РНК и количественного RT-PCR.
