使用流动细胞测量来检测和量化正在发育的斑马鱼中改变的血液形成

这个协议意义重大，因为它允许在发育中的鱼类中敲击和过度表达基因，以及这些下游对血细胞的影响的量化。此协议快速、易于执行、经济且易于自动化，可访问适当的仪器。证明这一程序的将是克里斯汀·鲁布，实验室的本科生研究员。

首先，在5至200之间，48小时后将受精胚胎转移到10厘米长的塑料培养皿中。倾斜菜，使胚胎下沉到底部边缘，并从菜中去除尽可能多的E3介质。然后在胚胎中加入500微升的脱毛蛋白酶。

在室温下5分钟后，将所有胚胎再次倒入盘子的底边缘，轻轻敲击盘子的侧面，让胚胎轻轻地摩擦盘子底部，完全去除它们的胆汁。使用挤压瓶添加约20毫升的E3介质稀释蛋白酶，并让胚胎沉淀。然后去除介质，用新鲜的介质再冲洗胚胎三次，就像刚刚证明的那样去除蛋白酶的所有痕迹。

要准备分离胚胎，使用 P1000 移液器将 5 到 10 个胚胎转移到一个 1.5 毫升的微离心管中，并吸气转移的 E3 介质。然后在E3介质中加入一毫升10毫升DTT到胚胎斑马鱼，并在室温下将微中线管置于水平位置30分钟，以去除粘液涂层。对于胚胎分离，用一毫升的DPBS来清洗DTT处理的胚胎三次，每次洗涤都补充钙和镁。

在加入500微升的DPBS补充钙和镁，和5微升每毫升5毫克，分离蛋白酶之前。然后在水平轨道摇床上以每分钟185转的速度在37摄氏度下孵化样品，时间为60分钟。一定要定期检查胚胎，这样你就不会过度消化它们了。

当一个不完全均匀的样品与一些固体组织存在时，用P1000移液器对胚胎进行三叉，直到样品完全分离。为了准备分离的斑马鱼胚胎细胞进行流动细胞测量，将整个细胞样本转移到一个5毫升聚苯乙烯圆底管的顶部储层，并带有35微米的细胞过滤器盖。用四毫升没有钙或镁的PBS冲洗盖子，并通过离心颗粒细胞。

然后在PBS的500微升中恢复细胞，每管不含钙和镁。对于斑马鱼胚胎细胞的流动细胞学分析，在给每个管子添加一千到一千个红死细胞污渍之前，轻轻漩涡细胞悬浮。在应用死细胞污渍的30分钟内，清空废水箱，用适当的溶液填充护套罐，启动流动细胞仪的流体系统。

在分析软件中，绘制五个绘图，并设置第一个绘图以测量前方与侧面散射。将向前散射设置为线性，侧面分散到对数。设置第二个图来测量前散射高度与前散射宽度，第三个图测量散射高度与侧散射宽度。

设置第四个绘图，以测量 x 轴上的红色死细胞污渍，并在 y 轴上侧散射，以便对死细胞中的活体进行区分。第五个情节应该设置为测量选择的氟。当所有绘图都设置完后，将样品加载到细胞仪上并降低流速，使细胞不会很快耗尽。

调整前部和侧面散射设置，以便可以清楚地观察到大部分细胞群，并在细胞群周围绘制一个门。标记此门单元格。随着第二个点图门控在细胞上，门在前进散射和侧面散射单打，以排除双打。

在第四个情节中，调整红色死细胞污渍设置，以便有明显的负数。在这些细胞周围画一个门，并标记此门活细胞。在第五个情节中，在活细胞上打开大门，在正细胞周围画一个门，然后运行每个样本，收集至少25，000个活细胞事件。

分析所有样品后，按照关闭程序关闭流体，重新填充护套罐并清空废水箱。在分析每个胚胎斑马鱼样本中GFP阳性红血球的百分比后，可以计算所有对照组的平均值。通常，平均值设置为一个百分比，所有百分比都是从此参考点计算的。

在这一具有代表性的分析中，确定用特定的变形金刚减少ISM1成绩单，减少受精胚胎后48小时内出现的GFP阳性红血球数量。通过外源性mRNA挽救ISM1变形金刚水平的降低，使红血球数量恢复正常。对样品进行适当的消化至关重要。

如果你过度消化或消化不足，你不会得到正确的结果。如果有传真机，研究人员可以通过对体外培养、RNA测序和定量RT-PCR进行分类来收集血细胞。