Этот протокол позволяет просто генерировать крупномасштабные сети липидных нанотрубок, в которых отдельные нанотрубки демонстрируют поведение разделения фаз, аналогичное поведению родительского пузырька. Ключевым преимуществом этого подхода является то, что мы кооптируем работу, проделанную молекулярными двигателями, для самостоятельной сборки липидных нанотрубок очень параллельным образом и без вмешательства человека. Чтобы настроить анализ скользящей подвижности, сначала прикрепите три комплекта двусторонних ленточных полос на стеклянный слайд на расстоянии пяти миллиметров друг от друга.
Аккуратно прижмите крышку на ленту и добавьте 30 микролитров одномикролярного раствора кинезина в подготовленную проточную ячейку. Через пять минут добавьте в клетку 30 микролитров раствора микротрубочек размером 10 микрограмм/миллилитр, осторожно прижимая лабораторную салфетку к противоположному концу проточного канала, чтобы облегчить обмен раствором. После еще одной пятиминутной инкубации промыть клетку один-три раза 50 микролитрами раствора для подвижности комнатной температуры за одну промывку, прежде чем добавлять 30 микролитров раствора стрептавидина 10 мкг/миллилитр стрептавидина в проточную клетку.
Через 10 минут добавьте 30 микролитров 10-кратного раствора ГУВ для 30-минутной инкубации при комнатной температуре. Затем добавляют два микролитра 100-миллимолярного раствора AMP-PNP и закрывают камеру герметиком. Перенесите проточную камеру в перевернутый микроскоп для визуализации и выберите соответствующий набор фильтров.
Используйте масляный объектив 100X, чтобы сфокусировать сначала поверхность скольжения крышки, прежде чем получить изображение интересующей сети. Затем откройте изображение в ImageJ и щелкните Изображение, Цвет и Композит, чтобы наложить красный и зеленый каналы для создания составного изображения. После получения изображения откройте интересующее изображение и нажмите «Проанализировать и установить масштаб», чтобы откалибровать шкалу для микроскопа.
Введите пикселы в коэффициент пересчета микрометра и нажмите кнопку ОК. Используйте инструмент многоточечной линии для трассировки нанотрубок, начиная с родительского GUV, а также нажмите и удерживайте Control и M для измерения длины. Инструмент обработки изображений будет сохранять каждое новое измерение в окне результатов. Когда все трубки будут измерены, выберите Изображение, Настройка и Пороговое значение и нажмите кнопку Применить, чтобы применить пороговое значение.
Затем нарисуйте прямоугольник известной длины над нужной трубкой. Чтобы измерить интегрированную плотность области, нажмите «Анализировать и измерять» Чтобы определить разделение липидов в узлах жидких нанотрубок, используйте инструмент «Линия», чтобы провести линию над интересующим узлом и измерить интенсивность узла как в зеленом, так и в красном каналах. В этом репрезентативном анализе были изготовлены сети жидких нанотрубок, которые, как было продемонстрировано, генерируют жидкие неупорядоченные и упорядоченные фазы, а также фазовые везикулы.
Например, везикулы, синтезированные с 45% насыщенными липидами и 55% ненасыщенными липидами, приводят к образованию везикул, которые разделяются на сосуществующие жидко-неупорядоченные и твердые фазы. Однако, если включить холестерин, можно наблюдать сосуществование жидкости и жидкости, создавая ГУВ, которые разделяются на сосуществующие жидко-упорядоченные и жидко-неупорядоченные фазы. Кроме того, узлы могут наблюдаться внутри фазоразделенных смесей.
Самое главное, что нужно помнить, это выбрать подходящее время экспозиции и установить фильтр ND, чтобы иметь возможность визуализировать липидные нанотрубки без фотоотбеливания флуорофоров. Адаптация состава фазового поведения липидных нанотрубок позволяет использовать минималистичную модельную систему, чтобы начать изучение биофизики туннельных нанотрубок, соединяющих клетки.
