Этот протокол описывает культуру мыши плода кишечных клеток, что лучше всего подходит для достижения созревания для взрослых этапе in vitro. Этот подход in vitro может быть использован для изучения молекулярных механизмов перехода от сосания к отею, а также модуляторов этого процесса и для достижения более эффективного использования экспериментальных животных. Это важно для этой модели in vitro созревания кишечника использовать первичные кишечные клетки с поздней стадии развития, между эмбриональным днем 18 и 20.
С двумя мелкими типсами, растянуть кишечник. Используя желудок и аппендикс в качестве направляющих, разрежьте проксимальные и дистальные части тонкой кишки. Используя аппендикс в качестве руководства, разрежьте толстую кишку на части.
Чтобы сделать кишечник открытым продольно, поместите лезвие бритвы вдоль кишечника и потяните кишечник, скользя миппы вдоль лезвия бритвы. Впоследствии разрежьте открытый кишечник на одну сантиметровую кусочки. Подготовь три 50-миллилитровые трубки с десятью миллилитров ледяного PBS.
Передача проксимальных и дистальных частей тонкой кишки и толстой кишки отдельно в трубы. Держите трубки на льду во время вскрытия кишечника дополнительных мышей. Соберите все кишечные части одного помета вместе в одной трубке.
После мытья кишечных частей с ледяной PBS, инкубировать с двумя миллимолярд EDTA в течение 30 минут. Чтобы отмежевать склепы от ткани, частично мыть кусочки с ледяной PBS и десять процентов икроножной сыворотки и фильтр через 70 микрон клеток ситечко в новую трубку. Повторите мытье ткани еще два раза и объединить фильтрованный раствор.
Центрифуга фильтрованного раствора, содержащего склепы при 150 раз G в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию, чтобы собрать склепы в качестве гранулы. Перенесите склепы в 15 миллилитровую трубку и центрифугу снова. Чтобы пластины скважин, добавить общее количество внеклеточного матричного геля, необходимого в трубку и растворить гранулы.
Добавьте 20 микролитров растворенных склепов в каждую колодец теплой пластины из 48 колодец. После покрытия первой колодец, посмотрите под микроскопом, чтобы подтвердить плотность около 250 до 300 склепов на колодец. Поместите пластину в инкубатор 37 градусов по Цельсию в течение десяти минут, чтобы внеклеточный матричный гель затвердеть.
Затем подготовьтесь к enR-среде. Добавьте 250 микролитров среды ENR в каждый колодец на гель. Изменение среды три раза в неделю и прохождение органоидов один раз в неделю.
В течение одного месяца, каждые три дня после каждого отрывка, анализировать культуру. Через три дня после каждого прохода изолируйте РНК из одной хорошо, добавив 200 микролитров буфера РНК-лиза, дополненного двумя микролитров бета меркаптоэтанола в колодец. Затем перенесите образец из колодец в RNAse-бесплатную 1,5 миллилитровую трубку.
В наших экспериментах in vitro мы использовали дексаметзон в качестве примера внешнего фактора, который, как известно, ускоряет созревание кишечника in vivo. Чтобы изолировать белок, добавьте 250 микролитров раствора восстановления холодных клеток на скважину в пять колодцев органоидов и соберите их все в 15 миллилитровую трубку. Инкубировать в течение по крайней мере 30 минут на льду, чтобы растворить внеклеточный матричный гель.
Вымойте ледяным PBS, добавьте 250 микролитров буфера клеточного лиза и храните при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Для анализа активности ферментов сначала приготовьте 0,625 молярного мужского буфера при рН 6 и 0,05 молярных растворов лактозы, сахарозы, мальтозы и трегалазы и храните их на льду. Подготовка стандартов анализа путем разбавления 5,56 раствора молярной глюкозы с ультра-чистой водой для получения растворов с 5 различными концентрациями.
Затем, в пластину из 96 колодец, добавьте восемь различных групп органоидных лизатов с их соответствующими субстратами, включая стандарты и контроль в соответствии с рукописью. Инкубировать в течение 60 минут при 37 градусах по Цельсию. Чтобы определить количество глюкозы, вырабатываемой ферментами, присутствующими в органоидном лизате, быстро добавьте 200 микролитров свежеприготовленного цветового раствора PGO и измерьте абсорбции на спектрофотометре на 450 нанометров каждые пять минут в течение тридцати минут при 37 градусах Цельсия.
В этом протоколе проксимальные и дистальные кишечники были изолированы от E18 до E20 плода мыши. После изоляции эпителиальные клетки были посеяны во внеклеточных матричных куполах геля. Примерно через 28-30 дней культуры органоиды плода развились до зрелого взрослого состояния.
Проксимальные маркеры Onecut2 и Gata4 были в основном выражены в проксимальной органоидной культуре, в то время как дистальные маркеры Fabp6 и Guca2a были в основном выражены в дистальной органоидной культуре. Фетальные маркеры лактазы, Ass1, Blimp-1 и неонатального рецептора Fc уменьшились в их относительной экспрессии и взрослых маркеров sucrase isomaltase, argenase 2, трегалазы и лизозима увеличилось с течением времени как в проксимальной и дистальной органоидной культуры. Последствия внешних факторов не обязательно должны быть геномными.
Экспрессия гена фетального маркера Blimp-1 была уменьшена на 12-й день для органовоидов, обработанных дексаметазоном, по сравнению с контрольными органоидами. Однако, как экспрессия генов, так и активность ферментов взрослых маркеров sucrase isomaltase были увеличены. При использовании этого протокола, важно понимать, что только поздней стадии плода органоиды способны транзита взрослых органоидов в пробирке.
Число от шести до десяти плодов в качестве отправной точки этой культуры может быть дополнительно уменьшено с помощью всего кишечника для изучения общего созревания. Переводная ценность этой модели заключается в возможности высокогрупповой экстремум-эффекторов, способных модулировать созревание кишечника, которое является процессом, сохраненным между сосание млекопитающих.
