このプロトコルは、インビトロで成人期に成熟を達成するのに最も適したマウス胎児腸細胞の培養を記述する。このインビトロアプローチは、吸引から乳への移行の分子メカニズムと、このプロセスのモジュレーターを研究し、実験動物のより効率的な使用を達成するために使用することができます。腸成熟のこのインビトロモデルは、胚の18日目から20日目の後期発達段階から原発性腸細胞を使用することが不可欠である。
2つの小さな鉗子で、腸を伸ばす。胃と付録をガイドとして使用して、小腸の近位部と遠位部分を切り離します。付録をガイドとして使用し、コロンを切り離します。
腸を縦方向に開くようにするには、かみそりの刃を腸に沿って縦に置き、カミソリの刃に沿って鉗子を滑らせて腸を引っ張ります。その後、開いた腸を1センチに切り取ります。氷冷PBSの10ミリリットルで3つの50ミリリットルチューブを準備します。
小腸と結腸の近位部分と遠位部分をチューブに別々に移します。追加のマウスの腸を解剖しながら、氷の上にチューブを保ちます.同じチューブに一緒に1つのごみのすべての腸の部分を収集します。
腸の部分を氷冷PBSで洗浄した後、2ミリモルEDTAで30分間インキュベートする。組織から暗号を解離するには、部分的に氷冷PBSと10%の子牛血清で片を洗浄し、70ミクロンの細胞ストレーナーを通して新しいチューブにフィルターします。組織を2回洗浄し、濾過した溶液を組み合わせます。
遠心分離剤は、ペレットとして納骨堂を収集するために摂氏4度で5分間Gの150倍の150倍の納骨堂を含む濾過溶液を圧縮する。15ミリリットルチューブと遠心分離機に再び納骨堂を移します。ウェルをプレートするには、必要な細胞外マトリックスゲルの総量をチューブに加え、ペレットを溶解します。
溶かした納骨堂の20マイクロリットルを暖かい48ウェルプレートの各井戸に加えます。最初の井戸をめっきした後、顕微鏡の下を見て、井戸あたり約250〜300の納骨堂の密度を確認します。プレートを摂氏37度のインキュベーターに10分間置き、細胞外マトリックスゲルを固化させます。
次に、ENR培地を準備します。ENR培地の250マイクロリットルをゲルに各ウェルに加えます。週に3回培地を交換し、オルガノイドを週に1回通過します。
1ヶ月間、各通過後3日ごとに、培養を分析する。各通過の3日後、2マイクロリットルのβメルカプトエタノールを添加したRNAリシスバッファーの200マイクロリットルをウェルに添加することによって、1つのウェルからRNAを分離する。その後、サンプルをアナーゼフリー1.5ミリリットルチューブに移します。
インビトロ実験では、インビボで腸の成熟を促進することが知られている外部因子の一例としてデキサメトソゾンを用いた。タンパク質を単離するには、オルガノイドの5つの井戸に井戸あたり250マイクロリットルの氷冷細胞回収溶液を加え、それらをすべて15ミリリットルのチューブに集めます。氷上で少なくとも30分間インキュベートし、細胞外マトリックスゲルを溶解する。
氷冷PBSで洗い、250マイクロリットルの細胞溶菌バッファーを加え、マイナス80度で保存します。酵素活性を分析するには、まずラクトース、スクロース、マルトース、トレハラーゼのpH 6および0.05モル溶液で0.625モルマリックバッファーを調製し、氷の上に保存します。5.56モルグルコース溶液を超純水で希釈し、5つの異なる濃度の溶液を得ることによって、アッセイ基準を調製します。
次いで、96ウェルプレートに、原稿に従って標準および制御を含むそれぞれの基質を用いて8つの異なるオルガノイドリセート群を加える。摂氏37度で60分間インキュベートします。オルガノイド溶解物中に存在する酵素によって生成されるグルコースの量を決定するために、迅速に調製したPGO色溶液の200マイクロリットルを加え、37°Cで30分の間、5分ごとに450ナノメートルで分光光度計の吸光度を測定する。
このプロトコルでは、近位および遠位腸をE18からE20マウス胎児に単離した。単離した後、上皮細胞を細胞外マトリックスゲルドームに播種した。約28〜30日後、胎児オルガノイドは成熟した成人状態に発達した。
近位マーカーOnecut2とGata4は主に近位オルガノイド培養で発現され、遠位マーカーFabp6およびGuca2aは主に遠位オルガノイド培養で発現した。胎児マーカーラクターゼ、Ass1、Blimp-1および新生児Fc受容体は、その相対的発現および成人マーカーのスクラーゼイソマルターゼ、アルゲナーゼ2、トレハラーゼおよびリソザイムの近位および遠位オルガノイド培養物の時間の経過とともに増加した。外因因子の影響は必ずしもゲノムである必要はない。
デキサメタゾン処理オルガノイドの胎児マーカーBlimp-1の遺伝子発現は、コントロールオルガノイドと比較して12日目に減少した。しかし、成人マーカーの遺伝子発現および酵素活性の両方がイソマルターゼを増強した。このプロトコルを使用する場合、後期胎児期オルガノイドのみがインビトロで成人オルガノイドに通過できることを認識することが重要です。
この培養の出発点となる6~10人の胎児の数は、腸全体を使用して全体的な成熟を研究することによってさらに減らすことができる。このモデルの翻訳値は、高いグループエクストリームエフェクターが、哺乳動物の間で保存されるプロセスである腸成熟を調節することができる可能性にある。
