Este protocolo descreve uma cultura de células intestinais fetais do camundongo que é a mais adequada para alcançar a maturação para o estágio adulto in vitro. Esta abordagem in vitro pode ser usada para estudar mecanismos moleculares de transição de amamentação para desmamar, bem como os moduladores desse processo e para obter um uso mais eficiente de animais experimentais. É essencial que este modelo in vitro de maturação intestinal use células intestinais primárias a partir do estágio de desenvolvimento tardio, entre os dias 18 e 20 embrionários.
Com dois fórceps pequenos, estique o intestino. Usando o estômago e o apêndice como guias, corte as partes proximais e distais do intestino delgado. Usando o apêndice como guia, corte o cólon.
Para fazer o intestino abrir longitudinalmente, coloque uma lâmina de barbear longitudinalmente ao longo do intestino e puxe o intestino deslizando fórceps ao longo da lâmina de barbear. Posteriormente, corte o intestino aberto em pedaços de um centímetro. Prepare três tubos de 50 mililitros com dez mililitros de PBS gelado.
Transfira as partes proximais e distais do intestino delgado e do cólon separadamente para os tubos. Mantenha os tubos no gelo enquanto disseca os intestinos de ratos adicionais. Junte todas as partes intestinais de uma ninhada no mesmo tubo.
Depois de lavar as peças intestinais com PBS gelado, incubar com dois milimães EDTA por 30 minutos. Para dissociar as criptas do tecido, lave parcialmente as peças com PBS gelado e 10% de soro de bezerro e filtre através de um coador de células de 70 mícrons em um novo tubo. Repita a lavagem do tecido duas vezes adicionais e combine a solução filtrada.
Centrifugar a solução filtrada contendo as criptas a 150 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius para coletar as criptas como uma pelota. Transfira as criptas para um tubo de 15 mililitros e centrífuga novamente. Para aplacar poços, adicione a quantidade total de gel de matriz extracelular necessário no tubo e dissolva a pelota.
Adicione 20 microliters das criptas dissolvidas em cada poço de uma placa quente de 48 poços. Depois de emplacar o primeiro poço, procure sob o microscópio para confirmar a densidade de cerca de 250 a 300 criptas por poço. Coloque a placa em uma incubadora Celsius de 37 graus por dez minutos para deixar o gel de matriz extracelular solidificar.
Em seguida, prepare o meio ENR. Adicione 250 microliters do meio ENR em cada poço no gel. Troque o meio três vezes por semana e passagem os organoides uma vez por semana.
Durante um mês, a cada três dias após cada passagem, analise a cultura. Três dias após cada passagem, isole o RNA de um poço adicionando 200 microliters de tampão de rna lysis complementados com dois microliters de beta mercaptoetanol ao poço. Em seguida, transfira a amostra do poço para um tubo de 1,5 mililitro sem RNAse.
Em nossos experimentos in vitro, usamos a dexamethosona como exemplo de um fator externo que é conhecido por acelerar a maturação intestinal in vivo. Para isolar a proteína, adicione 250 microliters de solução de recuperação de células geladas por poço a cinco poços de organoides e colete todos eles em um tubo de 15 mililitros. Incubar por pelo menos 30 minutos no gelo para dissolver o gel de matriz extracelular.
Lave com PBS gelado, adicione 250 microliters de tampão de lise celular e armazene a menos 80 graus Celsius. Para analisar a atividade enzimática, prepare primeiro o tampão 0,625 molar maleic em pH seis e 0,05 molares soluções de lactose, sacarose, maltose e trehalase e armazene-as no gelo. Prepare os padrões de ensaio diluindo a solução de glicose molar 5,56 com água ultra-pura para obter soluções com 5 concentrações diferentes.
Em seguida, em uma placa de 96 poços, adicione oito grupos diferentes de lise organoide com seus respectivos substratos, incluindo padrões e controle de acordo com o manuscrito. Incubar por 60 minutos a 37 graus Celsius. Para determinar a quantidade de glicose produzida pelas enzimas presentes no lisato organoide, adicione rapidamente 200 microliters de solução de cor PGO recém-preparada e meça absorvância no espectógrafo a 450 nanômetros a cada cinco minutos por trinta minutos a 37 graus Celsius.
Neste protocolo, o intestino proximal e distal foram isolados dos fetos do camundongo E18 a E20. Após o isolamento, as células epiteliais foram semeadas em cúpulas de gel de matriz extracelular. Após aproximadamente 28 a 30 dias de cultura, organoides fetais foram desenvolvidos para o estado adulto maduro.
Os marcadores proximais Onecut2 e Gata4 foram expressos principalmente na cultura organoide proximal, enquanto os marcadores distais Fabp6 e Guca2a foram expressos principalmente na cultura organoide distal. Os marcadores fetais lactase, Ass1, Blimp-1 e receptor neonatal Fc diminuíram em sua expressão relativa e marcadores adultos sucrase isomaltase, argenase 2, trehalase e lysozyme aumentaram ao longo do tempo em culturas organoides proximais e distais. Os efeitos dos fatores extrínsecos não devem necessariamente ser genômicos.
A expressão genética do marcador fetal Blimp-1 foi diminuída no dia 12 para os organoides tratados com dexametasona em comparação com os organoides de controle. No entanto, tanto a expressão genética quanto a atividade enzimática dos marcadores adultos sucrase isomaltase foram aumentadas. Ao utilizar este protocolo, é importante perceber que apenas organoides de estágio fetal tardio são capazes de transitar para organoides adultos in vitro.
O número de seis a dez fetos como ponto de partida dessa cultura pode ser ainda mais reduzido usando todo o intestino para estudar o amadurecimento geral. O valor translacional deste modelo reside na possibilidade de que os efeitos extremos de grupo elevado sejam capazes de modular a maturação intestinal, que é um processo conservado entre mamíferos sugadores.
