Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о прямой роли тау в ядерном отсеке, исключая при этом любое потенциальное цитоплазмическое загрязнение тау. Основным преимуществом этого метода является то, что он широко применим к изучению ядерной функции тау в других типах клеток и в различных клеточных условиях. Демонстрацией процедуры будет Джакомо Сиано, пост-док из моей лаборатории.
Начните с покрытия четыре раза 10 до пяти SH-SY5Y человека нейробластомы клеток линии клеток, которые будут трансфицированы с пустым вектором управления, четыре раза от 10 до пяти клеток, которые будут трансфицированы с untagged тау, четыре раза 10 до пяти клеток, которые будут трансфицированы с тау-NLS, и четыре раза от 10 до пяти клеток, которые будут трансфицированы с тау-РЭШ в отдельных скважин. На следующий день после покрытия, отдельно инкубировать 400 нанограммов ДНК и соответствующий объем катионых липидов в одну трубку из 250 микролитров уменьшенной сыворотки на колодец. Через пять минут при комнатной температуре смешайте каждый вектор с одним объемом катионых липидов и инкубировать липидные комплексы ДНК в течение 20 минут при комнатной температуре.
В конце инкубации замените супернатанты в каждом хорошо с двумя миллилитров свежей полной среды культуры и трансфект каждой хорошо с соответствующим раствором липидного комплекса ДНК для ночной инкубации при 37 градусах по Цельсию. На следующий день замените супернатанты свежей дифференциацией среды. Для западного анализа пятно, мыть трансфицированных и дифференцированных клеток в каждом хорошо с PBS и инкубировать клетки с 500 микролитров 0,1% трипсина на колодец в течение четырех минут при 37 градусов по Цельсию.
Когда клетки отсоединились, остановить реакцию с равным объемом полной среды и передачи клеточной подвески из каждого хорошо в отдельные трубы для центрифугации. После тщательного удаления supernatants, повторно гранулы в один миллилитр PBS на трубку для второй центрифугации и удалить supernatants снова. Для общего экстракта белка, инкубировать гранулы в течение 30 минут на льду в 50 до 100 микролитров лиза буфера дополняется протеазы и ингибиторы фосфатазы.
В конце инкубации центрифугировать экстракт в 16 000 раз г в течение 15 минут и количественно оценить концентрацию белка по любым стандартным количественным анализам. Затем смешайте 20 микрограммов каждого образца белка с пятью микролитерами буфера 4X Laemmli общим объемом 20 микролитров и варите образцы при 100 градусах Цельсия в течение пяти минут. Для субклеточной фракциорной, повторного перерасхода клеток в полной среде для подсчета и спина вниз один раз от 10 до шести клеток на образец.
Чтобы изолировать цитозолированную фракцию, инкубируйте гранулы в 100 микролитров буфера ледяной цитоплазмической экстракции, дополненного ингибиторами протеазы при четырех градусах Цельсия с нежным смешиванием в течение 10 минут. В конце инкубации соберите образцы путем центрифугации и перенесите супернатанты в предварительно охлажденные трубки. Добавьте 100 микролитров буфера извлечения ледяной мембраны, дополненного ингибиторами протеазы, к гранулам в течение 10 минут инкубации при четырех градусах Цельсия с нежным смешиванием.
Затем центрифугировать гранулы в течение пяти минут при четырех градусах цельсия и 3000 раз г и собирать супернатанты в новые трубки. Чтобы собрать растворимую ядерную фракцию, добавьте 50 микролитров буфера ядерной добычи, дополненных ингибиторами протеазы, к гранулам с вихрем перед инкубацией образцов при четырех градусах по Цельсию в течение 30 минут. В конце инкубации центрифугировать образцы и собирать супернатанты.
Для сбора нерастворимой ядерной фракции добавьте 50 микролитров буфера ядерной добычи, дополненных ингибиторами протеазы, хлоридом кальция и микрококковой нуклеазой к гранулам с вихрем. Инкубировать образцы в течение пяти минут при 37 градусах по Цельсию, прежде чем вихри и центрифугирования. Затем соберите супернатанты.
Для сбора цитоскелетной фракции добавьте 50 микролитров буфера цитоскелетной экстракции, дополненного ингибиторами протеазы, к гранулам с вихрем. После 10-минутной инкубации при комнатной температуре центрифугает образцы и собирает супернатанты. Для анализа SDS-PAGE добавьте семь микролитров буфера 4X Laemmli к 20 микролитров каждого из собранных образцов субклеточной фракции и варите образцы при 100 градусах цельсия в течение пяти минут.
В конце инкубации загрузите образцы на акриламидный гель и выполните электрофорез при постоянном напряжении 120 вольт. Затем перенесите белки в мембрану нитроцеллюлозы на 250 миллиампер в течение 90 минут. Инкубировать мембрану в течение пяти минут в Ponceau окрашивания раствор, чтобы проверить на наличие надлежащего белка гель электрофорез и успешное blotting.
В конце инкубации, промыть мембрану в дистиллированной воде, пока фон не будет чистым и удалить пятно с непрерывной стирки с Трис-буфер соленый дополняется Tween 20 в течение 10 минут на шейкере. Далее, инкубировать мембрану с блокирующим раствором в течение одного часа при комнатной температуре с встряхивания перед стиркой три раза с Tris-буферный солевой плюс Tween 20 в течение пяти минут за стирку. После последней стирки, гибридизировать мембрану с основным антителом интерес в блокировании раствора на ночь при четырех градусах по Цельсию, а затем три моет с Трис-буфер соленый плюс Tween 20 в течение пяти минут.
После последнего мытья, гибридизировать мембрану с соответствующим хреном пероксиды спряженных вторичных антител в блокировании раствора в течение одного часа при комнатной температуре перед мытьем мембраны с Трис-буферный солевой плюс Tween 20 три раза в течение пяти минут за стирку. После последней стирки, обнаружить белковую полосу с помощью хемилюминесценции и количественно интенсивность западных полос пятно ImageJ. При отсутствии ретинойной кислоты и нейротрофического фактора, полученного мозгом, недифференцированные клетки SH-SY5Y предполагают более круглую морфологию и образуют клеточные комки.
Как и ожидалось, после пяти дней лечения ретинойной кислотой, сгустки расслабиться и клетки распространяются. После трех дополнительных дней лечения нейротрофическим фактором, полученным мозгом, клетки появляются равномерно распределенными и взаимосвязанными через сеть разветвленных невритов. После тау-NLS или тау-РЭШ трансфекции, тау субклеточной локализации могут быть обнаружены иммунофторесценции с анти-тау антител.
В зависимости от эффективности трансфекции, клетки отображают сильное ядерное окрашивание, сливаясь с сигналом DAPI после трансфекции тау-NLS или цитоплазмического окрашивания пустыми ядрами после тау-РЭШ. Западный анализ помарки показывает обогащение актина в цитоскелетной фракции, тубулина в цитоплазмических и цитопскелетных фракциях и H2B в ядерных фракциях. Западный анализ пятно также подтверждает выражение помечены и untagged тау в ядерном отсеке и везикулярного глутамата транспортер одно выражение в общем экстракте.
Действительно, соотношение тау в растворимых ядерных и цитоплазмических фракциях подчеркивает тот факт, что тау-НЛЛ в значительной степени обогащается в растворимой ядерной фракции, в то время как тау-РЭШ снижается. Кроме того, тау-НЛЛ обогащается в фракции хроматина по отношению к цитоплазмической фракции, в то время как тау-РЭШ снижается. Обязательно проверьте количество клеток, используемых для фракции каждого образца, и проверьте обогащение генов домашнего хозяйства в соответствующих фракциях.
После просмотра этого видео, вы должны быть в состоянии изолировать сотовые отсеки и оценить функциональную роль тау в ядре.
