这种方法可以帮助回答有关tau在核舱中直接作用的关键问题，同时排除任何潜在的细胞质tau污染。该技术的主要优点是，它广泛适用于研究tau在其他细胞类型和不同细胞条件下的核功能。演示程序将是贾科莫西亚诺，一个后医生从我的实验室。
首先将四乘十十至五个SH-SY5Y人类神经母细胞细胞系细胞与空对照载体进行转染，四乘十至五细胞转染与未标记的tau，四乘十至五细胞转染为tau-NLS，四乘十至五细胞与tau-NES转染成六孔板的单个孔。电镀后的第二天，分别孵育400南克的DNA和适当的量阳离子脂到一管250微升减少血清每井。在室温下五分钟后，将每个载体与一卷阳离子脂结合，并在室温下孵育DNA脂质复合物20分钟。
在孵育结束时，用两毫升新鲜完整培养基代替每井的超级钠，并转染每井，用适当的DNA脂质复合溶液在37摄氏度下进行隔夜孵育。第二天，用新鲜的分化介质代替超级钠。对于西叶分析，用PBS洗涤每井中转染和分化的细胞，并在37摄氏度下用500微升0.1%的三叶草孵育细胞，四分钟。
当细胞分离后，停止反应，用等量的完整介质，将细胞悬浮液从每个井转移到单独的管中进行离心。小心去除超钠后，将颗粒重新浸入每管一毫升 PBS 中的颗粒进行第二次离心，然后再次去除超自然剂。对于总蛋白提取物，在50至100微升的解解缓冲液中孵育颗粒30分钟，并辅以蛋白酶和磷酸酶抑制剂。
在孵化结束时，将提取物以16，000次g离心15分钟，通过任何标准定量测定来量化蛋白质浓度。然后将每个蛋白质样品的20微克与5微升的4X Laemmli缓冲液混合到20微升的总体积中，并在100摄氏度下煮沸5分钟。对于亚细胞分馏，重新使用完整介质重新暂停细胞以进行计数，并向下旋转 10 倍到每个样本的 6 个细胞。
为了分离细胞酸分，孵育100微升冰冷细胞质提取缓冲液中的颗粒，在4摄氏度下辅以蛋白酶抑制剂，轻轻混合10分钟。在孵育结束时，通过离心收集样品，将超级钠转移到预冷管中。在4摄氏度下加入100微升冰冷膜提取缓冲液，并辅以蛋白酶抑制剂，在4摄氏度下进行10分钟的孵育，轻轻混合。
然后在4摄氏度和3000倍g下将颗粒离心5分钟，将超级钠收集到新的管中。为了收集可溶性核馏分，在4摄氏度下孵育样品30分钟之前，在颗粒中加入50微升的核萃取缓冲液，并辅以蛋白酶抑制剂。用涡流。在孵化结束时，将样品离心并收集中超。
为了收集不溶性核馏分，加入50微升的核萃取缓冲液，并辅以蛋白酶抑制剂、氯化钙和微球蛋白酶，加入涡流颗粒。在37摄氏度下孵育样品5分钟，然后涡旋和离心。然后收集超自然。
为了收集细胞骨骼分数，添加50微升的细胞骨骼提取缓冲液，并辅以蛋白酶抑制剂到含有涡流的颗粒中。在室温下孵育10分钟后，将样品离心并收集超钠。对于 SDS-PAGE 分析，在所收集的亚细胞分数样本的 20 微升中加入 7 微升 4X Laemmli 缓冲液，并在 100 摄氏度下将样品煮沸 5 分钟。
在孵育结束时，将样品装载到丙烯酰胺凝胶上，并在120伏的恒定电压下执行电泳。然后将蛋白质以250毫安将蛋白质转移到硝基纤维素膜上90分钟。在庞塞奥染色溶液中孵育膜五分钟，以检查是否适当的蛋白质凝胶电泳和成功的印迹。
在孵化结束时，用蒸馏水冲洗膜，直到背景清洁，并用Tris缓冲盐水连续清洗去除污渍，并在摇床上用Tween 20补充Tween 2010分钟。接下来，用阻尼溶液孵育膜，在室温下摇动一小时，然后用Tris缓冲盐水加Tween 20洗涤三次，每次洗涤五分钟。上次洗涤后，将膜与在四摄氏度下过夜阻断溶液的原抗体混合，然后用 Tris 缓冲盐水加 Tween 20 进行三次洗涤，持续五分钟。
上次洗涤后，将膜与适当的马萝卜过氧化物酶结合的二次抗体混合在室温下阻断溶液中一小时，然后用Tris缓冲盐水加Tween 20洗涤膜，每次洗涤5分钟。上次洗涤后，使用化学发光检测蛋白带，并通过 ImageJ 量化西 Blot 波段的强度。在没有视网膜酸和脑源神经营养因子的情况下，未分化的SH-SY5Y细胞假设一个圆状的形态并形成细胞团。
不出所料，经过五天的视网膜酸治疗后，团块会放松，细胞会扩散开来。在大脑衍生神经营养因子的另外三天治疗后，细胞通过分枝神经细胞网络出现均匀分布和互连。tau-NLS或tau-NES转染后，通过抗陶抗体的免疫荧光可以检测陶亚细胞定位。
根据转染的效率，细胞在tau-NLS转染后与DAPI信号合并，或在tau-NES后与空核进行细胞质染色。Western Blot 分析揭示了细胞骨骼分数内的行为素、细胞质和细胞骨骼分数内的多巴蛋白和核分数内的 H2B 的富集。西布洛特分析还确认了核舱内标记和未标记 tau 的表达，车辆谷氨酸运输器在总提取物中只表达一个表达式。
事实上，可溶性核和细胞质分中tau的比例突出了一个事实，即tau-NLS在可溶性核馏分中高度丰富，而tau-NES则减少。此外，tau-NLS 在细胞质分数的染色质含量中富含染色质含量，而tau-NES则减少。请务必仔细检查用于每个样本分馏的细胞数量，并验证在适当分数中内务基因的富集性。
观看此视频后，您应该能够隔离细胞隔离室并评估 tau 在细胞核中的功能作用。
