Этот протокол является результатом оценки ключевых аспектов подготовки библиотеки циркРНК, таких как тип комплекта, обработка RNase R, объемы ввода и их влияние на обнаружение циркРНК. Она обеспечивает оптимальное обнаружение циркРНК и предоставляет данные по регулируемым параметрам в зависимости от потребностей пользователя. Выявление циркРНК в различных типах образцов поможет нам лучше понять распределение их экспрессии и создаст основу для разграничения функциональной роли этих молекул.
Этот метод может быть применен к любой общей выборке РНК. Важно хранить образцы РНК на льду до начала протокола. Оцените значения RIN и DV200 на Agilent Bioanalyzer или TapeStation перед подготовкой и следуйте соответствующим процедурам при работе с РНК.
Начните с разбавления общей РНК до четырех микрограммов в 39 микролитров воды без RNase и трубопроводов его вверх и вниз, чтобы смешать. В отдельной трубке используйте 1x RNase R Buffer для разбавления RNase R до рабочей концентрации в два единицы на микролитер. Pipette 39 микролитров общей РНК и пять микролитров 10x RNase R Реакция буфера в 1,5-микролитровую реакцию трубки, и перемешать.
Добавьте шесть микролитров разбавленного RNase R.Then отрегулируйте пипетки до полного объема реакции и смешайте раствор, трубя вверх и вниз в 10 раз. Поместите трубку в 37-градусную ванну с водой по Цельсию в течение 10 минут, убедившись, что полный объем реакции погружается в водяную баню. Затем поместите трубку на лед, и сразу же приступить к очистке РНК и концентрации.
Перед началом, подготовить РНК мыть буфер путем смешивания концентрата с 48 миллилитров 100% этанола, и место очистки колонн в сбор труб. Когда он будет готов, добавьте два тома РНК-связывающего буфера в обработанный RNase R и хорошо перемешайте. Добавьте в смесь 150 микролитров 100% этанола в общей сложности 300 микролитров, перенесите весь объем на колонку и центрифугу на 30 секунд.
Удалите поток и добавьте 400 микролитров РНК Prep Buffer непосредственно к столбецу. Центрифуга в течение 30 секунд, и отбросить поток до конца. Затем добавьте 700 микролитров РНК Wash Buffer в столбец, центрифугу в течение 30 секунд и отбросьте поток.
Добавьте еще 400 микролитров буфера вымой, центрифуги на две минуты, и перенесите колонку в свежую 1,5-миллилитровую трубку без RNase. Аккуратно добавьте 11 микролитров воды без RNase непосредственно к колонке, удерживая наконечник пипетки прямо над фильтром столбца. Пусть образец сидит в течение одной минуты при комнатной температуре, а затем центрифуга его в течение одной минуты.
Убедитесь, что есть поток через в 1,5-миллилитровой трубки, и отбросить столбец. Очищенный образец РНК может храниться при температуре минус 80 градусов по Цельсию или немедленно использоваться для подготовки библиотеки. Передача 10 микролитров очищенной общей РНК в чистую колодец в 96-хорошо ПЦР пластины.
Добавьте пять микролитров rRNA Binding Buffer, а затем пять микролитров rRNA Removal Mix, затем аккуратно пипетку вверх и вниз, чтобы смешать реагенты. Печать пластины, и инкубировать его в течение пяти минут при 68 градусов по Цельсию на запрограммированный и разогретый термоциклер блока. После инкубации, пусть пластины сидеть при комнатной температуре в течение одной минуты.
Снимите уплотнение с тарелки и добавьте в образец 35 микролитров вихревых бусинок для удаления РНК комнатной температуры. Отрегулируйте пипетки до 45 микролитров, и пипетки вверх и вниз от 10 до 20 раз, чтобы тщательно перемешать. Пусть пластина сидеть при комнатной температуре в течение одной минуты.
Перенесите пластину на магнитный стенд и инкубировать ее там в течение одной минуты или до тех пор, пока раствор не прояснится. Перенесите супернатант в новую колодец на тарелке. Затем перенесите пластину с магнитного стенда на стенд пластины.
Vortex РНК очистки бисера, пока они хорошо рассеяны, и добавить 99 микролитров бисера в образец. Pipette вверх и вниз, чтобы смешать, и инкубировать пластины при комнатной температуре в течение 10 минут. Перенесите пластину на магнитный стенд и оставьте ее там на пять минут или до тех пор, пока раствор не прояснит, затем удалите и выбросьте все супернатанты из колодец.
С пластиной еще на магнитной подопечной, добавить 200 микролитров свежеприготовленного 80% этанола в колодец, не нарушая бисера. Оставьте этанол в колодец на 30 секунд, затем удалите и отбросьте его. Добавить 11 микролитров Elution Buffer в колодец, и пипетки его вверх и вниз, чтобы смешать.
Инкубировать пластину при комнатной температуре в течение двух минут, затем передать его обратно на магнитную подсвечение, и держать его там, пока раствор очищается. Перенесите 8,5 микролитров супернатанта в новую колодец на той же пластине и добавьте 8,5 микролитров Elute, Primer, Fragment High Mix к каждой хорошо содержащей образец. Pipette вверх и вниз 10 раз, чтобы тщательно перемешать, печать пластины, и инкубировать его в течение восьми минут в термоциклер разогрет до 94 градусов по Цельсию.
Охладить образец до четырех градусов по Цельсию, удалить пластину из термоциклера, и центрифуга его кратко. Для этого протокола были оценены два комплекта для подготовки библиотеки - TruSeq и KAPA. В целом, при использовании комплекта TruSeq было обнаружено большее количество циркулярных РНК и более низкий процент рибосомной РНК, поэтому TruSeq был выбран для дальнейших экспериментов.
Значение предварительной обработки RNase R оценивалось путем сопоставления данных, полученных из предварительно обработаваемых и необработавающих библиотек. Как и ожидалось, в заранее обработаваемых библиотеках последовательно выявлено большее число циркулярных РНК по сравнению с необработаваемыми. Объем входной РНК был оптимизирован для выявления более высокого разнообразия круговых РНК.
Библиотеки были подготовлены с использованием одного, двух и четырех микрограммов входной РНК, и при использовании четырех микрограммов общей РНК наблюдалось наибольшее разнообразие видов круговой РНК. Оптимизированный протокол был использован для сравнения кругового изобилия РНК в пяти областях мозга от четырех здоровых доноров и для других типов тканей от шести здоровых доноров. В целом, более высокое обилие круговой RNase наблюдалось в головном мозге по сравнению с другими типами тканей.
Важно помнить, чтобы следовать соответствующим процедурам при работе с РНК, в том числе носить перчатки, тщательно очистки скамейки и пипетки с RNase салфетки или спрей до начала протокола, и сохранение РНК на льду заранее. После этой процедуры может быть выполнена ортогональная проверка, такая как секвенирование Сэнгером выявленных соединений циркРНК. Открытие новых циркРНК и дополнительные доказательства их присутствия вырезает новую область исследований для изучения их биологических функций.
