Этот протокол имеет важное значение, поскольку он позволяет пользователю генерировать геномную систему выражения, которая может пройти альтернативное сращивание и в этом случае образуют круговые РНК, которые могут быть проверены на их функции и ассоциации болезней. Основным преимуществом этого метода является то, что он проложит путь для других, чтобы использовать этот протокол в молекулярной биологии и клонирования при изучении альтернативного сращивания в круговой формирования РНК и функции. Мой совет кому-то пытается этот метод в первый раз было бы оптимизировать условия ПЦР.
Выполнить градиенты или выполнить приземления ПЦР с различными температурами аннеаляций и времени расширения. Обычно более длинные фрагменты в течение шести КБ будут распространяться на один КБ за цикл, и различные температуры аннеализации должны быть проверены на лучшее усиление. Демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку он даст пользователям лучшее визуальное представление о более сложных аспектах процедуры, особенно генерации грунтовок.
Чтобы начать эту процедуру, загрузите UCSC Genome Browser и используйте его для выявления повторяющихся элементов, необходимых для кругового образования РНК и включения их в конструкции. Важно отметить, что грунтовки для усиления должны быть вне повторяющихся элементов. Вставьте круговую последовательность РНК в поиск блата человека и выберите правильный организм.
Отправить последовательность, перейти к просмотру браузера, и увеличить 1,5 таймеры или по мере необходимости. Затем мышь над повторяющимися элементами, чтобы определить их подтип в плавающем окне. Элементы Alu находятся в синусовой линии.
Используйте кнопку треки по умолчанию под окном, чтобы сбросить браузер, если неправильное изображение получено. Сначала перейдите к мнению, ДНК на верхней линии браузера генома USCS, чтобы загрузить последовательность ДНК показано в окне. В варианте форматирования последовательности выберите расширенные варианты корпуса/цвета.
Выберите случай по умолчанию как более низкий и выберите случай переключения для NCBI RefSeq. Выберите подчеркнуть и смелый и italic для RepeatMasker. Нажмите представить.
Там будут экзоны, как буквы и интроны, как нижние буквы. Проверьте границы экзон/интрон. Если браузер показывает обратный комплект, вернитесь назад и выберите поле обратного дополнения до тех пор, пока не будут показаны правильные границы exon/intron.
Затем скопировать файл с правильной ориентацией в документ обработки слов и выделить exons. Выберите фрагменты, которые будут усилены убедившись, что интрон не начинается или заканчивается в повторяющемся регионе, как грунтовки в этих регионах не будет усиливать конкретные последовательности. Для начала используйте веб-инструмент для разработки праймеров для клонирования.
Для векторной последовательности добавьте место вставки в качестве последнего нуклеотида и затем добавьте фрагменты. Поскольку номерирование вектора не начинается с данного места вставки, место вставки в векторе расположено, а часть вниз по течению помещена перед последовательностью вверх по течению. Отрегулируйте грунтовки, если их точки плавления более чем на четыре градуса цельсия друг от друга и не работают в усилении.
В этом исследовании, репортер генов, которые генерируют круговые РНК клонируются и анализируются. Оптимизированные продукты ПЦР разделены на 1%agarose гель, содержащий 1X гель зеленый. Отдельные полосы представляют продукты ПЦР, которые будут использоваться в энзиматической сборке ДНК.
Затем эти полосы вырезаются из геля и очищаются. Очищенный продукт ПЦР не соответствует ожидаемому размеру с гелем зеленый так продукты также разделены на 1%agarose гель, который впоследствии окрашенных бромистого этидия для обеспечения продуктов правильного размера. Для начала установите комплект для сборки энзиматической ДНК.
Объедините вектор и вставки в молярном соотношении один к двум. Далее добавьте 10 микролитров мастер-микса сборки ДНК. Инкубация образцов в течение 60 минут при 50 градусах.
Оттепель компетентных клеток на льду во время инкубации. Клетки должны быть в объеме 50 микролитров. Затем преобразуй компетентные ячейки с общей реакцией сборки.
Добавьте два микролитров охлажденного собранного продукта в компетентные клетки. Смешайте, аккуратно стряхивая трубку четыре-пять раз. Не вихрь.
Поместите смесь на лед в течение 30 минут. Тепло удар смеси при температуре 42 градусов по Цельсию в течение 30 секунд. Затем поместите его обратно на лед в течение двух минут.
После этого добавьте в трубку 950 микролитров средств связи комнатной температуры SOC. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 60 минут при встряхивании при 300 об/мин. Во время этой инкубации, тепло две пластины выбора, которые содержат соответствующие антибиотики.
После инкубации центрифуга реакционной трубки на 10 000 г в течение 30 секунд, чтобы гранулировать клетки и выбыть 25% клеток на одной пластине отбора и 75% на другой. Инкубировать эти пластины на ночь при 37 градусах по Цельсию. Прежде чем начать трансфекцию, проверьте свою ДНК путем ограничения пищеварения.
Здесь, представитель тау minigene, который содержит экзоны от девяти до 12 разрезается с ограничением ферментов указано, чтобы исключить основные рекомбинации. Для трансфекции сначала растворяют линейный полиэтиленовый гидрохлорид в воде при концентрации одного миллиграмма на миллилитр при рН два. Используйте гидроксид натрия, чтобы довести рН до семи и стерильный фильтр раствор с фильтром 0,22 микрометра.
Храните раствор при четырех градусах Цельсия до готовности к использованию. Затем разделить клетки на колодцы из шести скважин пластины и пусть они растут на ночь на DMEM сми, содержащих 10%FBS. На следующий день, aliquot один микрограмм сообщили гена в стерильной трубке и добавить 200 микролитров стерильных фильтрованных 150 миллимолярный хлорид натрия.
Смешайте вихрем. Далее добавьте к этой смеси раствор полиэтиленимина в соотношении трех микролитров полиэтиленимина на каждый микрограмм ДНК. Центрифуга кратко собирать образцы в нижней части трубки.
Инкубировать образцы при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем добавьте его непосредственно в клетки HEK293. Инкубировать клетки на ночь при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислого газа.
На следующий день используйте комплект изоляции РНК для изоляции РНК для RT-PCR. cDNA из двух образцов, полученных из тканей мозга человека усиливаются с круговой РНК грунтовки circ tau exon 1210 обратном и circ tau exon 1211 вперед. В то время как ожидаемая полоса, соответствующая тау круговой РНК видно, другие сильные полосы артефакты, которые не соответствуют геному человека.
Этот эксперимент повторяется с идентичными условиями ПЦР, но обратная транскрипция была выполнена только с circ tau exon 1210 обратной грунтовки. Только ожидаемая группа усиливается и проверяется с помощью последовательности. РНК затем лечится RNase R, который удаляет линейную РНК.
Круговая РНК обнаруживается после лечения, в то время как линейная РНК больше не дает обнаруживаемого сигнала. РНК изолирована в течение 24 часов после трансфекции и анализируется RT-PCR. Усиление линейной тау-мРНК показывает две полосы из-за альтернативного сращивания exon 10.
Их отношение меняется к чрезмерному выражению сращивания факторов. Усиление круговой РНК 1210 тау показывает зависимость экспрессии РНК тау-цирк от выражения некоторых факторов сращивания, особенно cdc2-подобной киназы CLK2 и белка SR 9G8. Самое главное помнить при попытке этой процедуры является дизайн и расположение грунтовки при строительстве minigene.
Праймер не должен лежать в повторяющихся элементах и должен быть оптимизирован в различных условиях в зависимости от фрагмента усиливается. После этой процедуры, другие методы, которые могут быть выполнены будет тестирование функции круговой РНК. Пользователи могут проверить перевод или секвестр белков, чтобы определить функцию для конкретной круговой РНК пользователь заинтересован в.
Этот метод проложил путь к использованию геномных фрагментов в минигенной системе, которая может более выразить круговые РНК, позволяющие пользователю проверить и определить их функцию и в некоторых аспектах их связь с болезнью. Смысл этого метода распространяется на потенциальные методы лечения и диагностики конкретного заболевания, например тауопатии, нейродегенеративные заболевания, связанные с тау патологией. Мы обнаружили, что микротрубочка связанных белка тау, известный как MAPT, генерирует круговые РНК, которые мы считаем, способствуют патологии болезни, и этот метод позволяет нам в полной мере изучить эти круговые РНК и выявления их функции и связи с болезнью.
Этот метод мог бы дать представление о более четком понимании круговых РНК, их функций и роли, которую они могут играть при некоторых заболеваниях. Этот метод может быть применен при клонировании других минигенов, которые выражают круговые РНК между видами, где он может дать представление об их функции. Усиление продуктов ПЦР оказывается наиболее трудным с длинными фрагментами усиливается из геномной ДНК, наряду с наличием нескольких повторяющихся элементов в фрагменте.
