Этот метод может обнаружить активность ретротранспозиций под названием LINE-1s. Эти мобильные генетические элементы вызывают де-ново вставки в геномы рака и тем самым способствуют геномной нестабильности. Преимущество этого метода на основе ПЦР заключается в том, что он прост и рентабельн по сравнению с высокой пропускной способностью подходов к последовательности.
Мы демонстрируем здесь свою полезность в обнаружении де Ново вставки, которые происходят из LINE-1 внутри гена TTC28 на хромосоме человека 22. LINE-1 активность может служить в качестве биомаркера для злокачественных новообразований или до злокачественности особенно в эпителиальных типов опухолей, как рак толстой кишки или высокого класса серозных рака яичников. Помимо вставок LINE-1, этот метод может обнаружить другие геномные аберрации, такие как перестановки ДНК, которые всегда нуждаются в перестановке по причине.
Для того, чтобы выбрать подходящий фермент ограничения, и для разработки обратных грунтовки, Во-первых, скачать TTC28 LINE-1 последовательности в формате FASTA из базы данных LINE-1, таких как L1Base. Идентификатор L1Base для TTC28 Line-1 составляет 135. Включите пять килобазы последовательности, фланговые как пять премьер и три премьер, конец линии-1 последовательности.
Экспорт последовательности в обработчик слова. Здесь последовательность фланговых линий-1 аннотирована коричневым шрифтом, а последовательности линии-1 серым шрифтом. Определить уникальный тег в одну килобазу последовательности вниз по течению от трех премьер TTC28 Line-1 и в один из инструментов прогнозирования сигнала полиаденилирования, таких как Polyadq или Dragon PolyA Spotter.
Аннотировать все полиаденилирования сигнала в этом окне одной килобазы. Последовательность между TTC28 LINE-1 собственной слабой полиаденилирования сигнала подчеркнул здесь в розовом и сильнейший полиаденилирование сигнала вниз по течению является уникальным тегом этого LINE-1 подчеркнул здесь желтым цветом. Для разработки обратных праймеров ПЦР введите уникальную последовательность тегов в веб-инструмент проектирования грунтовки, как NCBI в Primer-BLAST, который генерирует конкретные праймеры ПЦР, держать параметр длины продукта до минимума, чтобы показать грунтовки пары близки друг к другу.
Выберите соответствующую базу данных генома. Как выход Primer Blast генерирует обычные праймеры ПЦР лицом друг к другу, использовать функцию обратного дополнения для грунтовки пары для выполнения обратных ПЦР. Межпроектные грунтовки, соответствующие восточному полиаденилации сигнала, когда это возможно.
Мы соизволили три грунтовки пары, выделенные чирок и зеленый, соответствующие трем сильным полиаденилирования сигнала в уникальном теге TTC28 LINE-1. Далее, чтобы выбрать подходящий фермент ограничения, переварить последовательность LINE-1, вместе с его пятью килобазы вверх по течению и вниз по течению флангов в кремнезема с помощью веб-инструментов, таких как RestrictionMapper. Это даст полный список ограничений ферментов, которые переваривает эту причину, генерируя различные фрагменты ограничения.
Выберите ферменты ограничения, которые делают пять премьер сократить вверх по течению от LINE-1 пять премьер-конец или к пяти премьер конце LINE-1, если он находится в пределах LINE-1 себя. И три премьер-карты вниз по течению от уникального тега. Родной фрагмент ограничения с последовательностью LINE-1 и его уникальным тегом, сделанным ферментами селективного ограничения, не должен быть длиннее 12 килобазы, так как он не может быть усилен ПЦР эффективно.
Обратите внимание, что селективные ферменты ограничения будут нечувствительны к метилированию ДНК, должны быть тепло-инактивируемыми, и должны генерировать липкие концы, которые дополняют друг друга. Для того, чтобы продемонстрировать обратный ПЦР на большие расстояния, мы будем использовать фермент ограничения SacI, который режет ДНК на участках ДАЦТК, выделенных здесь светло-зеленым цветом. SacI выполняет все критерии на локусе TTC28 LINE-1 и генерирует родной фрагмент ограничения 5700 базовых пар.
Извлеките геномную ДНК из образцов с использованием коммерчески доступного комплекта для извлечения ДНК, который способен извлекать качественную, высокоя молекулярную ДНК, необходимую для дальнего обратного ПЦР. Здесь мы извлекли геномную ДНК из линии клеток рака молочной железы MCF7 и нормальной человеческой крови, используя инструкцию производства. Измерьте концентрацию ДНК с помощью флюорометра.
100 сотен нанограмм ДНК на одном человеке агарозный гель вместе с молекулярным маркером веса ДНК, чтобы проверить качество и количество ДНК. Чтобы сделать круговые шаблоны ДНК, сначала усваивается ДНК с подходящим ферментом ограничения. Здесь мы используем SacI для переваривания MCF7 и геномной ДНК крови Сделать пищеварения реакции смеси в соответствии с текстовым протоколом.
Смешайте раствор, кратко щелкнуть трубку и центрифугу. Инкубировать смесь реакции при температуре 37 градусов по Цельсию в течение часа, а затем тепловой инактивации, в соответствии с инструкцией производителя. Далее, сделать перевязку реакции мастер смеси решение в соответствии с текстовым протоколом для самостоятельной лигат переваренной ДНК.
Для каждой реакции добавьте 30 микролитров этой перевязонной реакции мастер-микс непосредственно к 50 микролитров переваренного раствора ДНК с предыдущего шага. Смешайте раствор, щелкивая трубку и центрифуга трубки кратко. Инкубировать эту реакцию смешивают в тепловой циклер при температуре 22 градуса по Цельсию в течение 10 минут, заканчивая тепловой инактивации шаг на 60 градусов по Цельсию в течение еще 10 минут.
Этот круговой шаблон ДНК будет использоваться в последующем обратном этапе ПЦР. Установите градиент температуры аннеаля в тепловом циклере, чтобы определить оптимальную температуру грунтовки по градиенту ПЦР. Подготовьте мастер-микс для PCR, объединив и смешивая все компоненты в соответствии с текстовым протоколом.
Наведи одну реакцию для каждой температуры в градиенте. Для каждой реакции выделите 19 микролитров мастер-микса ПЦР-трубок и добавьте один микролитр кругового шаблона ДНК, полученный из геномной ДНК крови. Запустите программу градиентного ПЦР.
Вы запустите шесть микролитров ПЦР-продукта, нагрейте его при разной температуре анеаля в одном курсе в агарозовом геле. Для обнаружения ретротранспозиционной активности de novo TTC28 LINE-1 в геноме клеточной линии MCF7 выполните ПЦР с помощью обратной грунтовки пары на круглых шаблонах ДНК, генерируемых из клеточной линии MCF-7. Следуйте тем же инструкциям, что и для градиента ПЦР, но на этот раз заменив градиент температуры оптимальной температурой аннеаля, которая составляет 64 градуса по Цельсию.
Для получения результатов проанализируйте обратные продукты ПЦР на большие расстояния с помощью агарозного геля. Это изображение агарозного геля, взятое после электрофоров, показывает геномную ДНК, извлеченную из MCF7, и образцы крови имеют высокий молекулярный вес, что делает его пригодным для обратного ПЦР на большие расстояния. Это изображение агарозного геля, взятое после электрофореза, показывает, что обратная грунтовка, которую мы разработали, усиливает правильный круговой шаблон при всех температурах аннеаляций в градиенте, наблюдаемых интенсивным диапазоном между 5 килобазией и семикилограммовым маркером ДНК.
Тем не менее, различные полосы также наблюдаются при более низких температурах, что указывает на плохую специфичность грунтовки и плохие температуры аннеаля. Таким образом, для этой грунтовой пары, 64 градусов по Цельсию является оптимальной температурой annealing. На этом изображении агарозного геля показан продукт ПЦР, полученный после выполнения обратного ПЦР на расстоянии на ДНК, извлеченной из клеточной линии MCF7 и нормальной крови.
Продукт PCF из 5700 базовых пар, отмеченный звездочкой, представляет собой родной ПЦР, соответствующий линии-1 в его родном локусе. Этот родной продукт ПЦР виден как в MCF7, так и в нормальной ДНК крови. Ретротранспозиция De novo LINE-1 и геном MCF7 обнаруживаются как продукт ПЦР разных размеров, наряду с родным продуктом ПЦР в агарозовом геле.
Секвенирование обратного продукта ПЦР на большие расстояния с помощью одномекулярных технологий секвенирования с длинным чтением может позволить идентифицировать идентификацию цели в ядерном разрешении. Хотя громоздкий подход, клонирование и санггер последовательности дальнего обратного продукта ПЦР также возможно. В этом видео была обнаружена активность LINE-1 на хромосоме 22.
Один и тот же рабочий процесс может быть адаптирован для мониторинга других LINE-1, которые активны в различных типах опухолей.
