שיטה זו יכולה לזהות את הפעילות של רטרטרנספוזיציות הנקראות LINE-1s. אלמנטים גנטיים ניידים אלה גורמים להכנסות דה נובו בגנומים של סרטן ובכך תורמים לחוסר יציבות גנומית. היתרון של טכניקה מבוססת PCR זו היא שהיא פשוטה וחסכונית בהשוואה לגישות של רצף תפוקה גבוהה.
אנו מדגימים כאן את השירות שלה בזיהוי הכנסות דה נובו שמקורן LINE-1 בתוך הגן TTC28 על כרומוזום אנושי 22. פעילות LINE-1 יכולה לשמש סמן ביולוגי עבור ממאירות או טרום ממאירות במיוחד בסוגי גידול אפיתל, כמו סרטן המעי הגס או סרטן השחלות סרוס בדרגה גבוהה. מלבד הכנסת LINE-1, שיטה זו יכולה לזהות סטייות גנומיות אחרות, כגון סידורים מחדש של דנ"א שתמיד זקוקים לסידור מחדש מסיבה מסוימת.
על מנת לבחור אנזים הגבלה מתאים, ולתכנן פריימרים הפוכים, ראשית, להוריד את רצף TTC28 LINE-1 בפורמט FASTA ממסד נתונים LINE-1, כגון L1Base. מזהה L1Base עבור TTC28 קו-1 הוא 135. כלול רצף של חמישה קילו-בבס, לצד חמישה ראשוניים ושלושה ראשוניים, סוף רצף קו-1.
יצא את הרצף למעבד תמלילים. כאן רצף האגפים של Line-1 מבואר בגופן חום ורצפי קו-1 בגופן אפור. כדי לקבוע את התג הייחודי לרצף קילבאס אחד במורד הזרם של שלושת הפריים של TTC28 Line-1 ולתוך אחד מכלי חיזוי אותות הפוליאדנילציה, כגון Polyadq או Dragon PolyA Spotter.
ביאור כל אות פוליאדנילציה בחלון קילו-באט אחד זה. הרצף בין אות הפוליאדנילציה החלש של TTC28 LINE-1 המודגש כאן בוורוד לבין אות הפוליאדנילציה החזק ביותר במורד הזרם הוא התג הייחודי של קו-1 זה המודגש כאן בצהוב. כדי לעצב פריימרים הפוכים של PCR הזן את רצף התגים הייחודי בכלי עיצוב פריימר מבוסס אינטרנט, כמו Primer-BLAST של NCBI שמייצר פריימרים ספציפיים של PCR, שמור על פרמטר אורך המוצר למינימום כדי להציג זוגות פריימר קרובים זה לזה.
בחר מסד נתונים מתאים של הגנום. כמו הפלט של הפיצוץ פריימר יוצר פריימרים PCR קונבנציונאלי מול אחד את השני, להשתמש בפונקציה משלימה הפוכה עבור זוג פריימר לבצע PCR הפוך. פריימרים בין-עיצוביים, המתאימים לאות פוליאדנילציה מזרחי בכל הזדמנות אפשרית.
יש לנו deigned שלושה זוגות פריימר, מודגש צהבהב וירוק, המתאים שלושה אות polyadenylation חזק התג הייחודי של TTC28 LINE-1. לאחר מכן, כדי לבחור אנזים הגבלה מתאים, לעכל את רצף LINE-1, יחד עם חמישה קילו-באזוב שלה במעלה הזרם במורד הזרם אגפים סיליקה באמצעות כלים מבוססי אינטרנט, כגון RestrictionMapper. זה ייתן רשימה מקיפה של אנזימי הגבלה המעכלים סיבה זו, יצירת שברי הגבלה שונים.
בחר אנזימי הגבלה שמייצרים חמישה פריים חתוכים במעלה הזרם של חמשת הפריים אנד של LINE-1 או לקראת חמשת הקצה העיקרי של LINE-1 אם הוא בתוך LINE-1 עצמו. ושלושה כרטיס ראש במורד הזרם מהתג הייחודי. קטע ההגבלה המקורי עם רצף LINE-1 והתג הייחודי שלו שנעשה על ידי אנזימי הגבלה סלקטיבית, לא צריך להיות ארוך יותר מ 12 קילו-באז, כפי שהוא לא יכול להיות מוגבר על ידי PCR ביעילות.
שים לב כי אנזימי ההגבלה הסלקטיבית יהיו חסרי רגישות ל- DNA מתילציה, צריך להיות חום בלתי ניתן להפעלה, וצריך ליצור קצוות דביקים כי הם משלימים זה לזה. על מנת להדגים PCR הפוך למרחקים ארוכים, נשתמש באנזים הגבלת SacI שחותך דנ"א באתרי DAZCTC המודגשים כאן בירוק בהיר. SacI עומד בכל הקריטריונים של לוקוס TTC28 LINE-1 ומייצר קטע הגבלה מקורי של 5, 700 זוגות בסיס.
לחלץ DNA גנומי מדגימות באמצעות ערכת מיצוי DNA זמין מסחרית כי הוא מסוגל לחלץ באיכות טובה, DNA מולקולרי גבוה הכרחי עבור PCR הפוך למרחקים ארוכים. כאן חילצנו דנ"א גנומי מקו התאים של סרטן השד MCF7 ודם אנושי רגיל באמצעות הוראת הייצור. למדוד את ריכוז ה-DNA באמצעות פלואורומטר.
1000 ננוגרם DNA על אדם אחד אגרוז ג'ל לצד סמן משקל מולקולרי DNA כדי לבדוק את איכות וכמות ה-DNA. כדי להפוך תבניות DNA מעגליות, תחילה לעכל את ה-DNA עם אנזים הגבלה מתאים. כאן אנו משתמשים SacI לעכל MCF7 ו- DNA גנומי דם להפוך תערובת תגובת עיכול על פי פרוטוקול טקסט.
מערבבים את הפתרון על ידי הפלת הצינור והצנטריפוגה בקצרה. להדק את תערובת התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה ואחריו איון חום, לפי הוראת היצרן. לאחר מכן, הפוך פתרון תמהיל ראשי תגובת קשירה על פי פרוטוקול הטקסט כדי ליגטה עצמית את ה-DNA מתעכל.
עבור כל תגובה, להוסיף 30 microliters של אמן תגובת קשירה זו לערבב ישירות 50 microliters של פתרון DNA מתעכל מהשלב הקודם. מערבבים את הפתרון על ידי הבהוב הצינור צנטריפוגה הצינור בקצרה. דגירה תגובה זו לערבב רוכב תרמי ב 22 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, מסיים עם שלב איון חום ב 60 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות נוספות.
תבנית DNA מעגלית זו תשמש בשלב PCR ההופכי הבא. הגדר שיפוע טמפרטורת חישול במחזור תרמי כדי לקבוע את טמפרטורת חישול פריימר אופטימלית על ידי PCR הדרגתי. הכן שילוב ראשי עבור PCR על-ידי שילוב ערבוב של כל הרכיבים בהתאם לפרוטוקול הטקסט.
הגדר תגובה אחת עבור כל טמפרטורת חישול במילוי ההדרגתי. עבור כל תגובה, להקצות 19 microliters של צינורות PCR לערבב הראשי ולהוסיף microliter אחד של תבנית DNA מעגלית, שנוצר DNA גנומי בדם. הפעל את תוכנית PCR הדרגתית.
הפעל שישה microliters של מוצר PCR, לחמם אותו בטמפרטורת חישול שונה במסלול אחד בג'ל אגרוז. כדי לזהות דה נובו TTC28 LINE-1 רטרטרנספוזיציה פעילות בגנום של קו תא MCF7, לבצע PCR באמצעות זוג פריימר הפוך על תבניות DNA מעגליות, שנוצר מקו תא MCF-7. בצע את אותן הוראות כמו PCR הדרגתי, אבל הפעם החלפת שיפוע הטמפרטורה עם טמפרטורת חישול אופטימלית, שהוא 64 מעלות צלזיוס.
נתח את מוצרי PCR ההופכיים למרחקים ארוכים על ידי ג'ל אגרוז לקבלת התוצאות. זה תמונת ג'ל agarose נלקח לאחר אלקטרופורזה מראה את ה-DNA הגנומי שחולצו MCF7 ודגימות דם יש משקל מולקולרי גבוה, מה שהופך אותו מתאים PCR הפוך למרחקים ארוכים. תמונה זו של ג'ל אגרוז שצולמה לאחר אלקטרופורזה מראה כי זוג פריימר ההופכי שתכננו מגביר את התבנית המעגלית הנכונה בכל טמפרטורות חישול בהדרגה כפי שנצפה על ידי טווח אינטנסיבי בין 5 קילו-בבס וסמן DNA של שבעה קילו-בבס.
עם זאת, להקות שונות נצפו גם בטמפרטורות נמוכות יותר, המציין ספציפיות פריימר עניים טמפרטורות חישול עניים. לכן, עבור זוג פריימר זה, 64 מעלות צלזיוס היא טמפרטורת חישול אופטימלית. זה תמונת ג'ל agarose מראה את המוצר PCR שהושג לאחר ביצוע PCR הפוך למרחקים ארוכים על DNA שחולצו מקו התא MCF7 ודם נורמלי.
מוצר PCF של 5, 700 זוגות בסיס, המסומנים בכוכבית, מייצג את ה- PCR המקורי המתאים לקו-1 על הלוקוס המקורי שלו. מוצר PCR מקורי זה גלוי הן MCF7 ו- DNA דם נורמלי. דה נובו LINE-1 retrotransposition ו MCF7 הגנום מזוהה כמוצר PCR בגדלים שונים, יחד עם מוצר PCR מקורי בג'ל אגרוז.
רצף מוצר PCR ההופכי למרחקים ארוכים על ידי טכנולוגיות רצף ארוך קריאה מולקולרית אחת יכול לאפשר זיהוי של זיהוי מטרה ברזולוציה גרעינית הדוקה. למרות גישה מסורבלת, שיבוט רצף סנגר של מוצר PCR הפוך למרחקים ארוכים אפשרי גם. בסרטון זה זוהתה הפעילות של קו-1 על כרומוזום 22.
אותה זרימת עבודה יכולה להיות מותאמת כדי לפקח על LINE-1s אחרים הפעילים בסוגי גידול שונים.
