Наш протокол может сопоставить малую молекуля химической связи между клетками и тканями, и мы специально применили это для изучения небольших молекул в метатезе рака яичников. Основным преимуществом нашей техники является способность измерять мелкие молекулы без этикетки, сохраняя при этом пространственную целостность клеток и тканей в 2D. Этот метод позволил нам допросить вклад малых молекул в метастазы рака яичников в нецелевых образом.
Это может обнародовать новые терапевтические цели и пути, которые ранее были упущены из виду. Эта методология может быть легко распространена на другие виды рака, которые могут быть выращены в агарозе и любой другой болезни, при которой пространственный компонент может иметь важное значение для результирующего клеточного фенотипа. Обеспечение того, чтобы все клетки и компоненты находятся в руках и терпение с процессом сушки имеет важное значение для этого протокола.
Поспешенный шаг высыхания часто может привести к низкое качество данных масс-спектрометрии. Визуальная демонстрация этого метода полезна в понимании наших этапов подготовки и высыхания образца, так как они сильно отклоняются от типичных экспериментов по масс-спектрометрии изображений, в ходе которого используются ткани или микробы на агаре. Для начала сжижают агарозу при 70 градусах по Цельсию на горячей тарелке.
Поместите разделитель из восьми колодец поверх обработанного ITO слайда. Через стандартное лечение трипсина, собирать клетки МЧС в 15-миллилитровой конической трубки, центрифуги, и добавить один раз DMEM сми для повторного перерасхода, чтобы получить концентрацию 50000 клеток на 150 микролитров, что в два раза превышает окончательную плотность желаемого. Для неразделенной кокультуры используйте миппы, чтобы добавить экзплант яичников в центр четырех скважин.
Незадолго до покрытия смешайте 200 микролитров клеточной подвески и 200 микролитров солодовенной агарозы в отдельных двухми миллилитровых трубках. Избегайте пузырьков воздуха во время пипетки. Немедленно добавьте 300 микролитров смеси клеточной агарозы к каждой скважине и нанесите непрерывное мягкое понижательное давление на разделитель, чтобы не было утечки или смешивания между скважинами.
Убедитесь, что нет пузырьков воздуха и яичник остается в центре колодец. Если pipetted агароза нарушила яичник, осторожно используйте наконечник пипетки, чтобы центр его, прежде чем агароза охлаждается. Затем инкубировать слайд при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислого газа в увлажненные инкубатора.
Для разделенных культур, вырезать разделители из тонкого, гладкого пластика. Используются стороны стерильного, одноразового медиа-бассейна. Вырезать их достаточно широко, чтобы плотно вписаться в гипотенузии хорошо.
Поместите делители из восьми колодцев поверх обработанного ITO слайда и вставьте пластиковые разделители по диагонали в колодцы. Подготовь клеточные культуры, как это было сделано ранее, и объедините 100 микролитров клеточной суспензии и 100 микролитров сликовой агарозы в двухми миллилитровую трубку. Сразу же пластина 150 микролитров клеточной агарозной смеси на одной стороне разделители при сохранении понижательного давления на разделитель.
Дайте агарозе остыть и затвердеть в течение примерно одной минуты, а затем удалите разделитель. Используйте типсы для установки яичников explant в центре пустой половины хорошо. Добавьте 150 микролитров клеточной агарозной смеси поверх яичника.
Инкубировать слайд при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислого газа во влажном инкубаторе. Через четыре дня снимите разделитель камеры с пробок агарозы. С помощью плоского шпателя отсоедините стороны агарозы от камеры и аккуратно потяните камеру вверх.
Если какие-либо вилки агарозы перемещаются, аккуратно перепозиционировать их так, чтобы они не касались друг друга. Поместите горку в 37-градусную духовку по Цельсию в течение примерно четырех часов и вращайся на 90 градусов каждый час, чтобы обеспечить равномерное распределение тепла по всему образцу. Слайд должен быть полностью высушен.
В противном случае это может привести к взрыву образца в высокой вакуумной среде масс-спектрометра MALDI-TOF. Сушка слайда и мониторинг прогресса является наиболее важным шагом для достижения высокого пространственного разрешения и качества спектра массы. Если происходит шелушение или чрезмерное морщины, мы не рекомендуем собирать данные о масс-спектрометрии.
С параметрами, установленными на матричном опрыскиватель, применить матричное решение для слайда. Чтобы использовать фосфор красный в качестве калибранта, добавьте один микролитер фосфорного красного в четкое место на слайде. Чтобы использовать пептидную смесь в качестве калибранта, смешайте ее с матрицей на Parafilm в соотношении один к одному, чтобы помочь ионизации, и пятно 0,5 к одному микролитер на слайде.
Подождите, пока калибрант высохнет перед получением данных о масс-спектрометрии изображений. Нарисуйте X с помощью постоянного маркера в каждом углу слайда, и возьмите оптическое изображение с помощью камеры или сканера на 1200 dpi. В этом эксперименте, тщательный мониторинг слайда в духовке имеет важное значение для обеспечения оптимального высушенного слайда ITO, в результате чего плоский высушенный образец с минимальными и без морщин по всей поверхности агарозы.
Эта цифра показывает морщины, которые следует избегать. Морщины могут слегка повлиять на высоту и, следовательно, точность массы изображения масс-спектрометрии сигналов. Незначительные морщины не повлияют на качество данных.
Оптимально расположенная ткань должна быть как можно ближе к центру. Используемая ткань должна быть в центре хорошо, если она неразделима или в центре половины треугольника, если она разделена так, чтобы приобретение данных IMS не было загрязнено эффектами края. Плохо расположенная ткань, при изображении, может привести к ложным сигналам массы от краевых эффектов.
Высушенное слайд-изображение используется для обучения масс-спектрометра MALDI-TOF, который регионы изображения. Небольшие области вокруг ткани яичников были отобраны для IMS на 50 микрометров. Репрезентативное изображение сигнала m-over-z отображается для неразделенной кокультуры, а также для разделенной установки камеры.
Самое главное помнить, что полученные данные только так хорошо, как подготовка образца. Обратите особое внимание на процесс сушки. Наиболее захватывающим аспектом является проверка малых молекул, обнаруженных таким образом, используя другие эксперименты, такие как вторжение анализы или колонизации анализы, чтобы сообщить об эффективной концентрации и перевести на биологию человека.
Мы ожидаем, что это откроет дверь, чтобы открыть новые пути потенциальных терапевтических целей для рака яичников, лучше понимая процессы в первичном метатезе рака яичников.
