Il nostro protocollo può mappare la comunicazione chimica di piccole molecole tra cellule e tessuti, e lo abbiamo applicato specificamente per esplorare piccole molecole nella metatesi del cancro alle ovaie. Il principale vantaggio della nostra tecnica è la capacità di misurare piccole molecole in modo privo di etichette mantenendo l'integrità spaziale di cellule e tessuti in 2D. Questa tecnica ci ha permesso di interrogare il contributo di piccole molecole nelle metastasi tumorali ovariane in modo non mirato.
Ciò potrebbe svelare nuovi obiettivi terapeutici e percorsi che sono stati precedentemente trascurati. Questa metodologia potrebbe essere facilmente estesa ad altri tumori che possono essere coltivati in agarosio e a qualsiasi altra malattia in cui una componente spaziale potrebbe essere importante per il fenotipo cellulare risultante. Garantire che tutte le cellule e i componenti siano in mano e la pazienza con il processo di asciugatura è essenziale per questo protocollo.
Una fase di essiccazione affrettata può spesso portare a dati di spettrometria di massa di scarsa qualità. La dimostrazione visiva di questo metodo è utile per comprendere le nostre fasi di preparazione e essiccazione del campione, poiché queste si discostano notevolmente dai tipici esperimenti di spettrometria di massa di imaging che usano tessuti o microbi sull'agar. Per iniziare, liquefare l'agarosio a 70 gradi Celsius su una piastra calda.
Posizionare il divisore a otto pozzi sopra la diapositiva trattata con ITO. Attraverso il trattamento standard della tripsina, raccogliere le cellule MOE in un tubo conico da 15 millilitri, centrifugare e aggiungere un supporto DMEM uno per resuspend per ottenere una concentrazione di 50.000 cellule per 150 microlitri, che è due volte la densità finale desiderata. Per le coculture indivise, utilizzare le flesse per aggiungere espianto ovarico al centro dei quattro pozzi.
Poco prima della placcatura, unire 200 microlitri di sospensione cellulare e 200 microlitri di agarosio liquecificato in singoli tubi a due millilitri. Evitare bolle d'aria durante la pipettazione. Immediatamente, aggiungere 300 microlitri della miscela cellula-agarosio ad ogni pozzo e applicare una pressione discendente delicata continua sul divisore per garantire che non perda o mescola tra i pozzi.
Assicurati che non ci siano bolle d'aria e che l'ovaio rimanga al centro del pozzo. Se l'agarosio pipettato disturbava l'ovaio, utilizzare delicatamente la punta della pipetta per centrarla prima che l'agarosio si raffredda. Quindi, incubare lo scivolo a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica in un incubatore umidificato.
Per coculture divise, tagliare divisori da plastica sottile e liscia. Vengono utilizzati i lati di un bacino multimediale sterile e monouso. Tagliarli abbastanza larghi da adattarsi perfettamente all'ipotenusa del pozzo.
Posizionare il divisore a otto pozzi sopra lo scivolo trattato con ITO e inserire divisori di plastica diagonalmente nei pozzi. Preparare le colture cellulari come fatto in precedenza e combinare 100 microlitri di sospensione cellulare e 100 microlitri di agarosio liquecificato in un tubo a due millilitri. Immediatamente, piastra 150 microlitri di miscela cellula-agarosio su un lato del divisore mantenendo la pressione verso il basso sul divisore.
Lasciare raffreddare e solidificare l'agarosio per circa un minuto, quindi rimuovere il divisore. Utilizzare le forcep per posizionare l'espianto dell'ovaio al centro della metà vuota del pozzo. Aggiungere 150 microlitri di miscela cellula-agarosio sopra la parte superiore dell'ovaio.
Incubare lo scivolo a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica in un incubatore umidificato. Dopo quattro giorni, rimuovere il divisore a camera dalle spine di agarosio. Con una spatola piatta, staccare i lati dell'agarosio dalla camera e tirare delicatamente la camera verso l'alto.
Se le spine di agarosio vengono spostate, riposizionarle delicatamente in modo che non si tocchino a vicenda. Posizionare lo scivolo in un forno Celsius di 37 gradi per circa quattro ore e ruotare di 90 gradi ogni ora per garantire una distribuzione uniforme del calore in tutto il campione. Lo scivolo deve essere completamente asciugato.
Altrimenti, può portare a un'esplosione del campione nell'ambiente ad alto vuoto dello spettrometro di massa MALDI-TOF. Asciugare lo scivolo e monitorare i progressi è il passo più critico per ottenere spettri di massa ad alta risoluzione spaziale e qualità. Se si verificano sfaldamento o rughe eccessive, si sconsiglia di raccogliere i dati della spettrometria di massa.
Con i parametri impostati sull'spruzzatore a matrice, applicare la soluzione a matrice alla diapositiva. Per utilizzare Phosphorus Red come calibante, aggiungere un microlitro di Phosphorus Red in una punto chiara sullo scivolo. Per utilizzare la miscela peptidica come calibante, mescolarla con matrice su Parafilm in un rapporto uno a uno per aiutare la ionizzazione e individuare da 0,5 a un microlitro sullo scivolo.
Attendere che il calibrant si asciughi prima di ottenere l'acquisizione di dati di spettrometria di massa. Disegna una X usando un marcatore permanente in ogni angolo della diapositiva e scatta un'immagine ottica usando una fotocamera o uno scanner a 1200 dpi. In questo esperimento, un attento monitoraggio dello scivolo nel forno è essenziale per garantire uno scivolo ITO essiccato ottimale, che si traduce in un campione piatto essiccato con rughe minime o nessuna sulla superficie dell'agarosio.
Questa figura mostra le rughe che dovrebbero essere evitate. Le rughe possono influenzare leggermente l'altezza e quindi la precisione di massa dei segnali di spettrometria di massa di imaging. Lievi rughe non influiranno sulla qualità dei dati.
Un tessuto situato in modo ottimale dovrebbe essere il più vicino possibile al centro. Il tessuto utilizzato dovrebbe essere al centro del pozzo se è indiviso o al centro del mezzo triangolo se è diviso in modo che l'acquisizione di dati IMS non sia contaminata da effetti sui bordi. Il tessuto mal posizionato, quando viene immaginato, può causare falsi segnali di massa dagli effetti del bordo.
L'immagine di scorrimento essiccata viene utilizzata per insegnare allo spettrometro di massa MALDI-TOF quali regioni image. Piccole regioni intorno al tessuto ovarico sono state selezionate per l'IMS a 50 micrometri. Un'immagine rappresentativa di un segnale m-over-z viene mostrata per le coculture indivise, così come per la configurazione della camera divisa.
La cosa più importante da ricordare è che i dati risultanti sono buoni solo quanto la preparazione del campione. Prestare particolare attenzione al processo di asciugatura. L'aspetto più eccitante è convalidare le piccole molecole scoperte in questo modo usando altri esperimenti, come test di invasione o test di colonizzazione, per informare sull'effettiva concentrazione e tradurre in biologia umana.
Ci aspettiamo che questo apra la porta alla scoperta di nuovi percorsi di potenziali obiettivi terapeutici per il cancro alle ovaie comprendendo meglio i processi nella metatesi primaria del cancro alle ovaie.
