Этот интегративный датчик напряжения на основе ДНК, или ITS, преобразовывающий силовой сигнал в флуоресценцию локально, обеспечивает прямую визуализацию клеточной силы с помощью микроскопии флуоресценции. ITS имеет высокое пространственное разрешение и высокую чувствительность. Порог активации настраивается, что позволяет выборочное изображение напряжения интегрина на разных уровнях.
После получения индивидуальной одноцепочечей ДНК, или ssDNA, представляющих интерес, чтобы спрягать пептид РГД в thiolated ssDNA утоличить, сначала добавить 100 микролитров 0,5-молар EDTA в 400 микролитров воды около 450 микролитров свежеприготовленного раствора TCEP. Затем добавьте 10 микролитров раствора TCEP-EDTA в 20 микролитров одномимиллярного тиола ДНК в PBS для 30-минутной инкубации при комнатной температуре. Чтобы спрягать RGD амин с сульфо-SMCC, добавьте 40 микролитров свежеприготовленного 23-миллимолярно-SMCC до 100 микролитров свежеприготовленного 11-миллимолярского раствора амина РГД для 20-минутной инкубации при комнатной температуре.
Чтобы спрягать RGD амин SMCC с thiolated ssDNA утоления, смешать весь объем тиадированных ssDNA утоления раствор со всем объемом RGD амин SMCC решение для одного часа инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации перенесите раствор на четырехградумное хранение по Цельсию на ночь. На следующее утро смешайте трехмяхлолярный хлорид натрия с раствором ДНК с тиолом и минус 20 градусов по Цельсию, охлажденным, 100%-ным этанолом в соотношении от 1 до 10 к 25, и поместите реакцию при температуре минус 20 градусов по Цельсию в течение примерно 30 минут.
Когда ДНК осаждается, собирать ДНК путем центрифугации, и повторно гранулы в PBS для измерения концентрации ДНК на спектрометре. Для датчика интегративного напряжения, или ITS, синтез, смешать верхнюю и нижнюю нить ДНК решений на 1,1 к одному молярного соотношения, и инкубировать реакцию на ночь на четыре градуса по Цельсию, прежде чем поместить aliquots смеси при минус 20 градусов по Цельсию для длительного хранения. Для иммобилизации ITS, пальто 29-миллиметровый диаметр, стекло-дно Петри блюдо с 200 микролитров 0,1 миллиграмма на миллилитр биотинилированных крупного рогатого скота сыворотки альбумин, или BSA-биотин, в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия.
Когда BSA-биотин физически адсорбирован на поверхности стекла, мыть блюдо три раза с 200 микролитров свежего PBS на стирку, а затем инкубации с 200 микролитров 50 микрограмм на миллилитр белка авидин в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. В конце инкубации, мыть блюдо три раза с PBS, как попродемонстрировано, и добавить 200 микролитров 0,1-микромолярной ITS еще 30-минутной инкубации при четырех градусах по Цельсию. В конце инкубации, мыть блюдо три раза с PBS, оставляя последнюю стирку в блюдо, пока ячейка покрытие.
Чтобы инициировать культуру кератоцитов рыбы, используйте пинцет с плоским наконечником, чтобы вырвать кусок шкалы из рыбы, и осторожно нажмите шкалу на колодец неизмененной стеклянной нижней чашки Петри, с внутренней стороны шкалы, контактной со стеклом. Подождите около 30 секунд для рыбной шкалы придерживаться стеклянной поверхности блюда, прежде чем покрыть шкалу с одним миллиметром полного Iscove в модифицированной Dulbecco's Medium. Затем инкубировать шкалу в темной и влажной коробке в течение шести-48 часов при комнатной температуре.
Чтобы выть кератоциты на поверхность ITS, замените среду из блюда культуры кератоцитов раствором 1X-клеток для трехминутной инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации замените отсоединеющий раствор свежей полной средой и отмежевать клетки от нежной трубы. Затем, настроить клетки к соответствующей концентрации для покрытия, и семена их на ITS покрытием блюдо в течение 30 минут при комнатной температуре перед визуализацией.
Для визуализации интегрина в живых клетках в режиме реального времени перенесите клетки на стадию флуоресцентного микроскопа и выберите цель в 40 или 100 раз. В программном обеспечении для визуализации установите время экспозиции до одной секунды и интервал кадра в 20 секунд, чтобы получить видео изображений ITS. Затем используйте соответствующую программу анализа изображений, чтобы вычесть предыдущий кадр видео ITS из текущего кадра для вычисления сигнала ITS, недавно произведенного в последнем интервале кадра.
Недавно произведенный сигнал ITS представляет собой интегринированное напряжение, генерируемое в последнем интервале кадра, тем самым сообщая о клеточной силе в квази-реальном времени. Здесь интегринное картирование напряжения демонстрирует индукцию интегринного напряжения на двух силовых путях во время миграции кератоцитов. Разрешение карты силы может быть откалибрована до 0,4 микрометра.
Высокое напряжение интегрина концентрируется на задней марже в разношерстных кератоцитах рыб. В немотильные клетки, конкретные интегрин напряженности картина, которая сильно отличается от наблюдаемых в быстро мигрирующих кератоцитов формируется. Координационные спайки и интегринное напряжение рыбных кератоцитов могут быть со-изображения для оценки взаимосвязи между интегрином напряженности и клеточной структуры в клетках, представляющих интерес.
С ITS сила клеточной адгезии становится видимой с разрешением и чувствительностью, сравнимой с клеточной структурной визуализацией. Этот метод прокладывает путь для изучения взаимодействия силовой структуры в клетках.
