Для измерения силы клеток используется силовая микроскопия тяги. Этот протокол упрощает анализ данных о тяговой силе, чтобы сделать их более доступными для неопытных пользователей. Основным преимуществом этого метода по сравнению с существующими платформами микроскопии силы тяги без ссылок является то, что мультифотонная литография позволяет быстро и легко работать в соответствии с индивидуальными экспериментальными потребностями.
Есть много ключевых шагов в изготовлении и реализации этой новой без ссылки тяги платформы, которые легче понять с помощью визуального представления, а не текст в одиночку. Для фотополимеризации базового гидрогеля сначала добавьте три микролитера дополимерного раствора на тонкий плоский лист перфтороалкокси алканов и поместите плоские 150-метровые полосы PDMS, окружающие, но не со контактные с каплей дополимного раствора. Поместите акрилат силанизированные крышки на PDMS, с предварительно-полимерной капли по центру под крышкой, чтобы сгладить предварительно полимерной капли до толщины PDMS промещиков.
Выставить зажатый предварительно полимерный раствор на ультрафиолетовый свет в течение одной минуты. Когда гидрогель полностью сформирован, тщательно отделить крышки от PDMS спейсеров. Используйте высокую производительность двусторонний акриловый клей, чтобы прикрепить открытое дно чашки Петри к крышке.
Прилипать к гидрогель-ладеновой крышке к чашке Петри особое внимание. Влажное блюдо или слишком мало давления во время применения позволит утечки форме, разрушая образец. Нанесите давление на клеевую контактную поверхность, чтобы создать полную печать между крышкой, клеем и чашкой Петри, заботясь о том, чтобы не треснуть стекло.
Используйте стерильные фильтрованные PBS для полоскания гидрогеля. Затем добавьте восемь микролитров NVP в 800 микролитров лабораторного раствора, подготовленных для синтеза гидрогеля. Чтобы преобразовать двоичное изображение в цифровую маску, откройте MATLAB и откройте и запустите runscript.
м сценарий MATLAB. Выберите файл binary TIF для преобразования и выберите папку для сохранения файлов региона. Вввечь желаемый окончательный размер в микроны выбранного изображения.
Входное изображение будет масштабироваться и размерироваться в соответствует этим параметрам. Чтобы создать единый пиксельный массив, в регионе параметры генератора интересов, не остановить удаление тик поле под малыми регионами / одиночные пиксели, проверить квадраты тик поле и бесконтрольно использовать под горизонтальными линиями перерыва. Затем щелкните OK. Файл OVL будет найден в ранее указанной папке.
Откройте файл в программном обеспечении микроскопа и загрузите нужные области, которые контролировали лазерный затвор во время двух фотон лазерного сканирования литографии. Следующие шаги должны выполняться в условиях с минимальным светом. Для изготовления фидуциальных маркерных массивов при условиях низкой освещенности тщательно смешайте 200 микролитров ранее подготовленного лабораторного раствора NVP с 20 миллиграммами Alexa Fluor 633 и удалите все PBS из блюда, содержащего гидрогель.
Добавьте смесь PEG-633 к гидрогелю в качестве капли, которая полностью охватывает базовый гидрогель и загрузите чашку Петри на образец держателя стадии микроскопа. Затем накройте блюдо и дайте узорчатому раствору замочить в гидрогеле не менее 30 минут, защищенном от света. Чтобы настроить микроскоп для визуализации, выберите соответствующие лазеры и фильтры для визуализации Alexa Fluor 488.
Найдите гидрогель с помощью сигнала PEG-488 и блокируйте сбор длинных длин волн выбросов от детектора. Используйте вертикальные и горизонтальные сканирование плитки, чтобы найти центр гидрогеля в плоскости XY и обнулить этап в этом положении. Используйте сканирование линий в функции «К-стек», чтобы найти поверхность гидрогеля и обнулить фокус в этом положении.
Уровень гидрогеля, повторяя линии сканирует от центра XY для определения положения поверхности, регулировка набора винтов для стадии микроскопа, по мере необходимости. В рабочей области программного обеспечения микроскопа создайте отдельный экспериментальный файл для фотопаттернинга и установите мощность мульти-фотона до 1,8% и скорость сканирования до шести. Отрегулируйте размер кадра изображения и пикселей, чтобы достичь размера пикселя 0,1 микрометра на пиксель и соотношения сторон 100 к одному и загрузить файл регионов во вкладку региона.
Используйте макрос, чтобы настроить все регионы для приобретения и включаемой функции «К-стек». Установите расстояние до 3,5 микрометров на общую глубину 28 микрометров и общее количество ломтиков по девять. Затем используйте функцию Позиции для определения определенных мест на гидрогеле, где фидуциальные маркерные массивы будут фотопаттернированы.
По мере приближения времени замачивания к 30-минутной отметке, приобретайте последовательные сканирование линии q-stack поверхности гидрогеля каждые пять минут, чтобы проверить отек на основе изменений в расположении поверхности относительно обнуляемого положения фокусировки. Если за пятиминутный интервал не произошло никаких изменений в положении поверхности, запустите настройки узора и используйте лазер 488 нанометров, чтобы убедиться, что поверхность гидрогеля не двигается во время узора. Затем снимите гидрогель с микроскопа, аспирировать раствор PEG-633 из чашки Петри и промыть блюдо стерильным фильтрованным PBS.
Чтобы получить изображения ячейки и фидуциального маркера, верните чашку Петри владельцу образца, чтобы найти узорчатые области. Найдите ячейку, представляющие интерес, и приобретете передаваемое или флуоресцентное изображение клетки. Затем приобрети стопку узорчатого массива под ячейкой, как это было продемонстрировано, и приобрети второй набор передаваемых или флуоресцентных изображений клетки.
При сборе стека изображений полученные изображения должны отображать обычный массив узорчатых объектов, которые колеблются по интенсивности в качестве функции положения в стеке изображений. Отслеживание. m скрипт предоставляет несколько диагностических изображений, в том числе й-проекцию флуоресцентных фидуциальных маркеров для оценки качества предварительной обработки, участок обнаруженных центроидов, цвет, закодированный как функция положения q для оценки качества обнаружения объекта, и участок треков, представляющих обнаруженные центроиды маркера, которые были связаны в столбцы в направлении q для оценки качества отслеживания объекта.
Скрипт DISP 3D.m обеспечивает участок интенсивности в качестве функции положения q для каждого столбца обнаруженных объектов в данном стеке изображений для оценки качества профилей интенсивности фидуциальных маркеров. Оба DISP 3D.
м и disP стрижка. м вместе обеспечивают гистограммы измеренного шума смещения в каждом из декартовых размеров координат, а также интерполированные тепловые карты смещения. Кроме того, final3D_2.
m предоставляет тепловые карты поверхностных тяг, рассчитанные с использованием внешнего кода. Самое главное помнить во время этой процедуры является то, что решения, содержащие LAP чувствительны к свету и должны быть защищены как можно больше от источников окружающего света. Помните, что NVP является летучим органическим соединением и всегда должен быть обработан в капюшоне химического потока.
