Este sensor de tensão integrativa baseado em DNA, ou ITS, convertendo sinal de força em fluorescência localmente permite a imagem direta da força celular com microscopia de fluorescência. Its tem uma alta resolução espacial e uma alta sensibilidade. O limiar de ativação é incapaz, permitindo imagem seletiva de tensão integrin em diferentes níveis.
Depois de receber o DNA de um único fio personalizado, ou SSDNA, de interesse, para conjugar peptídeo RGD ao ssDNA quencher thiolado, adicione primeiro 100 microliters de 0,5-molar EDTA em 400 microliters de água para cerca de 450 microliters de solução DEP recém-preparada. Em seguida, adicione 10 microliters da solução TCEP-EDTA a 20 microliters de um mililitro de DNA thiol de um mililitro em PBS para uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente. Para conjugar amina RGD com sulfo-SMCC, adicione 40 microliters de sulfo-SMCC recém-preparado de 23 milimolares a 100 microliters de uma solução de amina RGD de 11 mililitros recém-preparada para uma incubação de 20 minutos à temperatura ambiente.
Para conjugar o RGD amine SMCC com o ssDNA quencher thiolado, misture todo o volume da solução ssDNA quencher com todo o volume da solução RGD amine SMCC para uma incubação de uma hora à temperatura ambiente. No final da incubação, transfira a solução para o armazenamento Celsius de quatro graus durante a noite. Na manhã seguinte, misture o cloreto de sódio de três molares com a solução de DNA conjugada com tiol e menos 20 graus Celsius, refrigerado, 100% etanol em uma proporção de 1 a 10 a 25, e coloque a reação a menos 20 graus Celsius por cerca de 30 minutos.
Quando o DNA tiver precipitado, colete o DNA por centrifugação, e resuspenque a pelota na PBS para medir a concentração de DNA em um espectrômetro. Para o sensor de tensão integrativa, ou ITS, síntese, misture as soluções de DNA do fio superior e inferior a uma relação de 1,1 para um molar, e incubar a reação durante a noite a quatro graus Celsius antes de colocar alíquotas da mistura a menos 20 graus Celsius para armazenamento a longo prazo. Para a imobilização its, cubra uma placa de Petri de 29 milímetros de diâmetro, com 200 microliters de 0,1 miligrama por mililitro biotinilado, ou BSA-biotina, por 30 minutos a quatro graus Celsius.
Quando a BSA-biotina tiver adsorvida fisicamente na superfície do vidro, lave o prato três vezes com 200 microliters de PBS fresco por lavagem, seguido de incubação com 200 microliters de 50 microgramas por mililitro de proteína avidina por 30 minutos a quatro graus Celsius. No final da incubação, lave o prato três vezes com PBS como demonstrado, e adicione 200 microliters de 0,1 micromolar ITS para outra incubação de 30 minutos a quatro graus Celsius. No final da incubação, lave o prato três vezes com PBS, deixando a última lavagem no prato até a cela emplacando.
Para iniciar uma cultura de ceratocito de peixe, use uma pinça de ponta plana para arrancar um pedaço de escala de um peixe, e pressione suavemente a balança para o poço de uma placa petri de fundo de vidro não modificada, com o lado interno da balança entrando em contato com o vidro. Aguarde cerca de 30 segundos para que a balança de peixe adera à superfície de vidro do prato antes de cobrir a balança com um milímetro de Meio Modificado de Dulbecco de Iscove completo. Em seguida, incubar a balança em uma caixa escura e úmida por seis a 48 horas em temperatura ambiente.
Para emplacar os ceratocitos na superfície ITS, substitua o meio do prato de cultura de ceratocitos por uma solução de desapego de células 1X para uma incubação de três minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, substitua a solução de desapego por meio completo fresco e dissocia as células com tubulação suave. Em seguida, ajuste as células à concentração apropriada para chapeamento e semee-as no prato revestido de ITS por 30 minutos à temperatura ambiente antes da imagem.
Para imagens de tensão integrin quase em tempo real em células vivas, transfira as células para o estágio de um microscópio de fluorescência e selecione o objetivo de 40 ou 100 vezes. No software de imagem, defina o tempo de exposição para um segundo e o intervalo de quadros de 20 segundos para obter um vídeo das imagens ITS. Em seguida, use um programa de software de análise de imagem apropriado para subtrair um quadro anterior do vídeo ITS de um quadro atual para calcular o sinal ITS recém-produzido no intervalo de quadro mais recente.
O sinal ITS recém-produzido representa a tensão integrin gerada no último intervalo de quadros, relatando assim a força celular de forma quase em tempo real. Aqui, o mapeamento da tensão integrin demonstra a indução da tensão integrin em duas faixas de força durante a migração de ceratocitos. A resolução do mapa de força poderia então ser calibrada para 0,4 micrômetros.
A alta tensão integrin concentra-se na margem traseira em ceratocitos de peixe motile. Em células não-ltil, forma-se um padrão específico de tensão integrin bastante diferente do observado no ceratocito migratório rápido. Aderências focais e a tensão integrin de ceratocitos de peixe podem ser co-imagens para avaliar a relação entre tensão integrin e estrutura celular em células de interesse.
Com o ITS, a força de adesão celular torna-se visível com uma resolução e uma sensibilidade comparável à imagem estrutural celular. Essa técnica abre caminho para o estudo de uma interação de estrutura de força nas células.
