Этот метод позволяет не только локализации, но и количественной оценки кандидатов mRNAs в отдельных яйцеклеток и эмбрионов. По сравнению с другими анализами, включая ПЦР, завершение метода приводит к воспроизводимым данным с низкими вариациями. Демонстрацией процедуры будет Келси Тимм, аспирант моей лаборатории.
Начните эту процедуру с подготовки необходимого материала и самок мышей в возрасте от пяти до восьми недель, как описано в текстовом протоколе. Очистите мышь, используя 70% этанола. Выставить брюшную полость и визуализировать женский репродуктивный тракт.
Держите яичник с типсами и удалить связки матки и избыток жировой ткани со всего яичника. Вырежьте яйцеклетку из матки. Затем поместите пару яичников яйцеклетки в теплую холдинговую среду в 35-миллиметровое блюдо.
Удалите яичник и любые окружающие жировой ткани. Разорвать опухшие ампулы из яйцеклетки с помощью половины дюйма 27 калибровочных игл. Нажмите овидука в месте слезоточивый и кучевые клеточные ооцитные комплексы будут исключены.
Использование рот пипетки для передачи овуляции яйцеклеток на 100 микролитер капли, содержащей проведение среды с гиалуронидазы. Чтобы выбить кучевые клетки, пипетка метафазы двух ооцитов кумулятивных клеточных комплексов вверх и вниз в гиалуронидазе, содержащей проведение среды с ртом пипетки. После того, как они лишены кучевых клеток, используйте рот пипетки для передачи каждого яйцеклетки для мытья капли, содержащей только проведение среды.
Повторите это для каждой капли стирки. Не переносите фрагментированные или прозрачные яйцеклетки. Для выполнения SM-FISH окрашивания, сначала зафиксните яйцеклетки в отдельном колодец из шести хорошо пластины, содержащей 500 микролитров буфера фиксации.
Погрузите 20 яйцеклеток или меньше в колодец. Инкубировать яйцеклетки в буфер фиксации в течение 20 минут при комнатной температуре. После мытья яйцеклеток, как описано в текстовом протоколе, инкубировать яйцеклетки в буфере пермяки в течение 30 минут при комнатной температуре.
После очередной стирки перенесите яйцеклетки на 80 микролитров предварительно разбавленной протеазы три буфера в течение 30 минут при комнатной температуре. Разбавить разогретые пробуретые наборы для Nanog, Pou5f1 и DapB от одного до 50 в разбавлении зонда. Инкубировать ооциты в 80 микролитров стенограммы конкретного зонда в течение двух часов при 40 градусах по Цельсию.
Когда яйцеклетки находятся в зонде и буферах AMP, они, как правило, плавают. Очень важно, чтобы вы погрузили яйцеклетки, осторожно толкая их в буфер. Перенесите яйцеклетки на 500 микролитров буфера стирки и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.
Теперь инкубировать яйцеклетки последовательно в буферах усиления. Во-первых, инкубировать ооциты в 80 микролитров AMP1 в течение 30 минут при 40 градусах по Цельсию. Затем перенесите яйцеклетки на 500 микролитров буфера стирки в течение 10 минут при комнатной температуре.
Далее инкубируют ооциты в 80 микролитров AMP2 в течение 15 минут при 40 градусах Цельсия. После мытья яйцеклеток, как и прежде, инкубировать яйцеклетки в 80 микролитров AMP3 в течение 30 минут при 40 градусах по Цельсию с последующим окончательным мытьем. Наконец, добавьте ооциты до 80 микролитров AMP4FL в течение 15 минут при 40 градусах цельсия.
Пипетка 12 микролитров анти-увядание монтажной среды на центр слайда, не добавляя пузырьков к реагенту. Передача ооцитов с как можно меньше буфера мытья в монтажной среде. Наконец, нанесите крышку скольжения.
Изображение трехмерных яйцеклеток с помощью конфокарной микроскопии и сохранить изображения, описанные в текстовом протоколе. Перетащите файлы ND2 на Фиджи и выберите Hyperstack. Нажмите на вкладку Изображение, выберите цвет и нажмите Split Channels, чтобы отделить флуоресцентные каналы файла ND2.
Создайте отдельные файлы TIFF для каждого ломтика яйцеклеток в каждом флуоресцентном канале. Для этого нажмите на вкладку Изображение, выберите стеки и нажмите Стек на изображения. Затем нажмите на вкладку Изображение, выберите тип и нажмите RGB Color, чтобы преобразовать каждый срез в отдельное цветное изображение RGB.
Сохраните каждое преобразованное изображение в качестве файла TIFF. Поместите изображения из одного яйцеклетки для каждого флуоресцентного канала в новую папку, чтобы избежать путаницы во время сшивания. После нормализации файлов, описанных в текстовом протоколе, нажмите на вкладку Plugins, выберите Stitching и нажмите на Grid Collection.
Выберите последовательные изображения из меню высадки и нажмите Ok. Просмотрите каталог и выберите папку, содержащую все изображения срезом для отдельного яйцеклетки на одной длине волны. Нажмите Хорошо.
Переместив ползунок в нижней части сшитого изображения на соответствующий цветной канал для используемой длины волны. Создайте окончательное RGB сшитое изображение, нажав на изображение, выбрав тип и нажав RGB Color. Преобразуем сшитое изображение в 32-битную максимально проецируемую картинку.
Для этого щелкните изображение, выберите тип и нажмите 32-битный. Сохраните это изображение в качестве нового файла TIFF. Откройте 32-битное сшитое изображение в программе поиска и отслеживания месте.
Выберите локализовать падение и нажмите Локализируйте, который вычислит количество пятен, найденных на изображении. Здесь показана количественная оценка мРНК с помощью спот-истера и отслеживания. Синяя стрелка указывает на положительный сигнал выше порога.
Белая стрелка показывает флуоресцентное пятно ниже порога и поэтому не учитывается. Впоследствии количество мРНК было проанализировано с помощью стандартного инструмента анализа данных. Репрезентативные изображения изображения средней серии показаны для Pouf51 и Nanog.
DAPI окрашивание хромосом выровнены на метафазе два шпинделя показано в белом цвете. Данные, собранные в этом протоколе показали 775 Pouf51 стенограммы и 113 Наног стенограммы в метафазе двух яйцеклеток. Важно отметить, что не было обнаружено пятен в ооцитах, которые помечены зондом DapB, который служил отрицательным контролем.
При использовании непритязательных ячеек важно эмпирически определить наилучшее разбавление буфера протеазы из комплекта SM-FISH. обнаружение мРНК было протестировано с использованием кривой титрование неразбавленных и нескольких разбавленных концентраций буфера протеазы в 1xPBS. Разбавление протеазы, используемое в этом протоколе, было от одного до восьми, так как оно показало наименьшее изменение среднего флуоресцентного экспрессии Pouf51 mRNA в метафазе двух ооцитов.
Одновременно иммунофлуоресценция целевого белка может быть выполнена для того, чтобы со-локализовать мРНК с РНК связывающим белком. Совместное локализация мРНК с белками, связывающими РНК, позволяет следователям определить механизмы, регулирующие хранение, перевод и деградацию мРНК в яйцеклетке или эмбрионе.
