טכניקה זו מאפשרת לא רק לוקליזציה, אלא גם כימות של mRNAs מועמד ב oocytes בודדים ועוברים. בהשוואה למסיונות אחרים, כולל PCR, השלמת הטכניקה גורמת לשחזור נתונים עם וריאציה נמוכה. הפגנת ההליך תהיה קלסי טים, סטודנטית לתואר שני במעבדה שלי.
התחל הליך זה עם הכנת החומר הנדרש ועכברים נקבה בגיל חמישה עד שמונה שבועות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. נקה את העכבר באמצעות 70%אתנול. לחשוף את חלל הבטן לדמיין את מערכת הרבייה הנשית.
החזק את השחלה עם מעצורים ולהסיר את רצועות הרחם ואת רקמת שומן עודף מסביב השחלה. חותכים את האוביאדוקט מהרחם. לאחר מכן, מניחים את זוג oviduct השחלה במדיום החזקה חם בצלחת 35 מילימטר.
הסר את השחלה ואת כל רקמת השומן שמסביב. לקרוע את האמפולה הנפוחה של oviduct באמצעות מחט מד חצי אינץ '27. לדחוף את oviduct באתר של דמעה קומולוס תא oocyte מתחמים יסולקו.
שימוש בפיפלטת פה להעברת הביציות הביוץ לירידה של 100 מיקרוליטר המכילה אחזקה בינונית עם היאלואורונידס. כדי לנטרל תאים קומולוס, פיפטה metaphase שני קומפלקסים תא cumulus oocyte למעלה ולמטה ב hyaluronidase המכיל מחזיק בינוני עם פיפטה הפה. ברגע שהם נטולי תאי קומולוס, השתמש פיפטה הפה להעביר כל oocyte טיפת לשטוף המכיל רק מחזיק בינוני.
חזור על זה עבור כל טיפת לשטוף. אין להעביר בוציטים מפוצלים או שקופים. לביצוע כתמי SM-FISH, תחילה תקן בוציטים באר בודדת של צלחת בארות המכילה 500 מיקרוליטרים של מאגר קיבעון.
טביעה 20 oocytes או פחות באר. הדגירה את oocytes במאגר קיבוע במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת הוציטים כמתואר בפרוטוקול הטקסט, דגירה oocytes במאגר permeablization במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר שטיפה נוספת, מעבירים את הוציטים ל-80 מיקרוליטר של חיץ פרוטאז 3 מדולל מראש למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לדלל את סטים מחומם בדיקה עבור ננוג, Pou5f1, ו DapB אחד עד 50 ב diluent בדיקה. הדגירה oocytes ב 80 microliters של החללית הספציפית תעתיק במשך שעתיים ב 40 מעלות צלזיוס.
כאשר oocytes נמצאים בבדיקה ואת מאגרי AMP, הם נוטים לצוף. זה חיוני כי אתה להטביע את oocytes על ידי בעדינות דוחף אותם לתוך המאגר. מעבירים את הוציטים ל-500 מיקרוליטרים של חיץ כביסה ודגירה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
עכשיו, הדגירה oocytes ברצף במאגרי הגברה. ראשית, הדגירה oocytes ב 80 microliters של AMP1 במשך 30 דקות ב 40 מעלות צלזיוס. לאחר מכן מעבירים את הוציטים ל-500 מיקרוליטרים של חיץ כביסה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, הדגירה oocytes ב 80 microliters של AMP2 במשך 15 דקות ב 40 מעלות צלזיוס. לאחר שטיפת oocytes כמו קודם, לה הדגיר את oocytes ב 80 microliters של AMP3 במשך 30 דקות ב 40 מעלות צלזיוס ואחריו לשטוף הסופי. לבסוף, להוסיף oocytes ל 80 microliters של AMP4FL במשך 15 דקות ב 40 מעלות צלזיוס.
פיפטה 12 מיקרוליטרים של מדיום הרכבה נגד עמעום למרכז שקופית מבלי להוסיף בועות לריג'נט. מעבירים את הוציטים עם מאגר שטיפה קטן ככל האפשר לתוך מדיום ההרכבה. לבסוף, החל שובר כיסוי.
תדמיין את הוציטים התלת מימדיים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל Z-step ושמור את התמונות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. גרור קבצי ND2 לתוך פיג'י ובחר Hyperstack. לחצו על הכרטיסייה 'תמונה', בחרו 'צבע' ולחצו על 'פיצול ערוצים' כדי להפריד בין ערוצי הפלואורסצנטיים של קובץ ND2.
צור קובצי TIFF בודדים עבור כל פרוסת Z של הוציטים בכל ערוץ פלואורסצנטי. לשם כך, לחצו על הכרטיסייה 'תמונה', בחרו 'ערימות' ולחצו על 'מחסנית לתמונות'. לאחר מכן, לחצו על הכרטיסייה 'תמונה', בחרו 'כתב' ולחצו על 'צבע RGB' להמרת כל פרוסת Z לתמונה צבעונית בודדת של RGB.
שמור כל תמונה שהומרה כקובץ TIFF. מקם תמונות מ- oocyte יחיד עבור כל ערוץ פלואורסצנטי בתיקיה חדשה כדי למנוע בלבול במהלך התפירה. לאחר נרמול הקבצים כמתואר בפרוטוקול הטקסט, לחץ על הכרטיסיה תוספים, בחר תפירה ולחץ על אוסף רשת.
בחרו 'תמונות רציפות' מהתפריט הנפתח ולחצו על הלחצן 'אשר'. עיינו בספריה ובחרו את התיקייה הכוללת את כל תמונות פרוסת Z לקבלת בוציט בודד באורך גל אחד. לחץ על אישור.
הזז את המחוון בתחתית התמונה התפורה לערוץ הצבע המתאים לאורך הגל בו נעשה שימוש. צור את התמונה התפורה הסופית של RGB על-ידי לחיצה על תמונה, בחירה באפשרות אות ולחיצה על צבע RGB. המר את התמונה התפורה לתמונה מוקרנת מרבית של 32 סיביות.
לשם כך, לחץ על תמונה, בחר סוג ולחץ על 32 סיביות. שמור תמונה זו כקובץ TIFF חדש. פתח את התמונה התפורה של 32 סיביות בתוכנית איתור ומעקב אחר נקודות.
בחרו ברשימה הנפתחת 'התאמה לאוקליזציה' ולחצו על 'התאמה לאוקליזציה', שתחשב את מספר הנקודות שנמצאו בתמונה. מוצג כאן הוא כימות של mRNAs באמצעות מאתר נקודה ומעקב. החץ הכחול מצביע על אות חיובי מעל הסף.
החץ הלבן מראה נקודה פלואורסצנטי מתחת לסף ולכן לא נספר. ספירות mRNA נותחו לאחר מכן באמצעות כלי ניתוח נתונים סטנדרטי. תמונות מייצגות של תמונת סדרת Z האמצעית מוצגות עבור Pouf51 ו- Nanog.
כתמי DAPI של כרומוזומים המיושרים במטה-פאזה שני צירים מוצגים בלבן. הנתונים שנאספו בפרוטוקול זה הראו 775 תעתיקים Pouf51 ו 113 תעתיקים ננוג ב metaphase שני oocytes. חשוב לציין, לא היו כתמים שזוהו ב oocytes המסווים עם בדיקה DapB, אשר שימש שליטה שלילית.
בעת שימוש בתאים שאינם חסידים, חשוב לזהות באופן אמפירי את הדילול הטוב ביותר של מאגר פרוטאז מערכת SM-FISH. זיהוי mRNA נבדק באמצעות עקומת טיטריות של ריכוזי מאגר פרוטאז לא מדוללים ב- 1xPBS. דילול פרוטאז בשימוש בפרוטוקול זה היה אחד עד שמונה כפי שהוא הראה את הווריאציה הנמוכה ביותר בביטוי פלואורסצנטי הממוצע של Pouf51 mRNA במטהפאזה שני oocytes.
במקביל ניתן לבצע אימונו-פלואורסצנטיות של חלבון יעד על מנת להפוך את ה-mRNA ללאוקליזציה עם חלבון מחייב RNA. לוקליזציה של mRNAs עם חלבונים מחייבים RNA מאפשר לחוקרים לקבוע מנגנונים המסדירים אחסון mRNA, תרגום, השפלה בתוך oocyte או עובר.
