هذه التقنية لا تسمح فقط توطين، ولكن أيضا كمية من mRNAs المرشح في البويضات الفردية والأجنة. مقارنة مع المقايسات الأخرى، بما في ذلك PCR، والانتهاء من نتائج تقنية في بيانات استنساخ مع اختلاف منخفض. إثبات الإجراء سيكون (كيلسي تيمي) طالبة دراسات عليا في مختبري
ابدأ هذا الإجراء بإعداد المادة المطلوبة وفئران الإناث في عمر خمسة إلى ثمانية أسابيع كما هو موضح في بروتوكول النص. تنظيف الماوس باستخدام 70٪ الإيثانول. كشف تجويف البطن وتصور الجهاز التناسلي للأنثى.
أمسك المبيض مع ملقط وإزالة أربطة الرحم والأنسجة الدهنية الزائدة من جميع أنحاء المبيض. قطع oviduct من الرحم. ثم، ضع زوج أوفيدوج المبيض في عقد دافئ المتوسطة في طبق 35 ملليمتر.
إزالة المبيض وأي الأنسجة الدهنية المحيطة. المسيل للدموع ampullae منتفخة من oviduct باستخدام نصف بوصة 27 قياس إبرة. دفع oviduct في موقع المسيل للدموع وسيتم طرد مجمعات البويض خلية cumulus.
باستخدام ماصة الفم لنقل البويضات المبيضة إلى قطرة 100 ميكرولتر التي تحتوي على عقد المتوسطة مع الهيالورونيداز. لطرد خلايا الركام، الماصات ميتافاسيس اثنين من مجمعات الخلايا البويضية عابس صعودا وهبوطا في الهيالورونيداس التي تحتوي على عقد المتوسطة مع ماصة الفم. مرة واحدة أنها خالية من خلايا الركام، واستخدام ماصة الفم لنقل كل بويضة إلى قطرة غسل تحتوي على المتوسط فقط عقد.
كرر هذا لكل قطرة الغسيل. لا تقم بنقل البويضات المجزأة أو الشفافة. لأداء تلطيخ SM-FISH، قم أولاً بإصلاح البويضات في بئر فردية من لوحة 6 آبار تحتوي على 500 ميكرولترات من مخزن التثبيت المؤقت.
غمر 20 بويضة أو أقل في البئر. احتضان البويضات في حاجز التثبيت لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل البويضات كما هو موضح في بروتوكول النص، بويضات احتضان في عازلة permeablization لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
بعد غسل آخر، نقل البويضات إلى 80 ميكرولترات من protease المخففة مسبقا ثلاثة العازلة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تمييع مجموعات مسبار دافئ ل Nanog ، Pou5f1 ، وDapB واحد إلى 50 في مسبار diluent. تحضن البويضات في 80 ميكرولترات من التحقيق المحدد نسخة لمدة ساعتين في 40 درجة مئوية.
عندما تكون البويضات في المسبار والمخازن AMP ، فإنها تميل إلى التعويم. من الضروري أن تغمر البويضات عن طريق دفعها بلطف إلى المخزن المؤقت. نقل البويضات إلى 500 ميكرولترات من عازلة غسل واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
الآن، بويضات احتضان بشكل تسلسلي في مخازن التضخيم. أولا، احتضان البويضات في 80 ميكرولترات من AMP1 لمدة 30 دقيقة في 40 درجة مئوية. ثم نقل البويضات إلى 500 ميكرولترات من العازلة غسل لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
المقبل، احتضان البويضات في 80 ميكرولترات من AMP2 لمدة 15 دقيقة في 40 درجة مئوية. بعد غسل البويضات كما كان من قبل، احتضان البويضات في 80 ميكرولترات من AMP3 لمدة 30 دقيقة في 40 درجة مئوية تليها غسل النهائي. وأخيرا، إضافة البويضات إلى 80 ميكرولترات من AMP4FL لمدة 15 دقيقة في 40 درجة مئوية.
ماصة 12 ميكرولترات من مضادة تتلاشى تصاعد المتوسطة على وسط شريحة دون إضافة فقاعات إلى الكاشف. نقل البويضات مع أقل قدر ممكن من الغسيل العازلة في المتوسطة المتصاعدة. وأخيراً، قم بتطبيق قسيمة زلة.
صور البويضات ثلاثية الأبعاد باستخدام المجهر النقوش ثلاثي الخطوات وحفظ الصور كما هو موضح في بروتوكول النص. اسحب ملفات ND2 إلى فيجي واختر Hyperstack. انقر فوق علامة التبويب صورة، حدد اللون، وانقر على تقسيم الأقنية لفصل القنوات الفلورية للملف ND2.
إنشاء ملفات TIFF فردية لكل شريحة Z من البويضات في كل قناة فلورية. للقيام بذلك، انقر فوق علامة التبويب صورة، حدد مكدسات، ثم انقر فوق مكدس إلى صور. ثم انقر فوق علامة التبويب صورة، حدد الكتابة، وانقر فوق RGB Color لتحويل كل شريحة Z إلى صورة ملونة RGB فردية.
حفظ كل صورة تم تحويلها كملف TIFF. ضع صورًا من بويضة واحدة لكل قناة فلورية في مجلد جديد لتجنب الارتباك أثناء الخياطة. بعد تسوية الملفات كما هو موضح في بروتوكول النص، انقر فوق علامة التبويب الإضافات، وحدد خياطة، وانقر على مجموعة الشبكة.
حدد صور متسلسلة من القائمة المنسدلة وانقر على "حسنا". تصفح الدليل وحدد المجلد الذي يحتوي على كافة الصور شريحة Z لبويضة فردية في طول موجة واحد. انقر فوق "حسناً".
حرك شريط التمرير الموجود في أسفل الصورة المخيطة إلى قناة اللون المناسبة للطول الموجي المستخدم. إنشاء الصورة النهائية RGB مخيط عن طريق النقر على صورة، وتحديد نوع، والنقر على RGB اللون. قم بتحويل الصورة المخيطة إلى صورة مُسقطة بحد أقصى 32 بت.
للقيام بذلك، انقر فوق صورة، حدد الكتابة، وانقر فوق 32 بت. حفظ هذه الصورة كملف TIFF جديد. افتح الصورة المخيطة 32 بت في برنامج البحث عن النقاط وتتبعها.
حدد القائمة المنسدلة Localize وانقر على Localize، والتي ستحسب عدد البقع الموجودة في الصورة. يظهر هنا هو الكم من mRNAs باستخدام مكتشف بقعة وتتبع. يشير السهم الأزرق إلى إشارة إيجابية فوق العتبة.
السهم الأبيض يظهر بقعة الفلورسنت تحت العتبة وبالتالي لا يتم حسابها. تم تحليل تعدادات الـ MRNA في وقت لاحق باستخدام أداة تحليل بيانات قياسية. يتم عرض صور تمثيلية لصورة سلسلة Z الأوسط لPouf51 و Nanog.
يتم عرض تلطيخ DAPI من الكروموسومات الانحياز على المغزل metaphase اثنين باللون الأبيض. وأظهرت البيانات التي تم جمعها في هذا البروتوكول 775 نسخة Pouf51 و 113 نسخة نانوغ في اثنين من البويضات metaphase. الأهم من ذلك، لم تكن هناك بقع اكتشفت في البويضات التي وصفت مع مسبار DapB، والتي كانت بمثابة السيطرة السلبية.
عند استخدام الخلايا غير المنضمة، من المهم أن تحدد تجريبيا أفضل تخفيف من عازلة البروتياز من مجموعة SM-FISH. تم اختبار الكشف عن مرنا باستخدام منحنى المعايرة من تركيزات ثنائية ومخففة متعددة في 1xPBS. كان تخفيف البروتياز المستخدم في هذا البروتوكول من واحد إلى ثمانية حيث أظهر أدنى تباين في متوسط التعبير الفلوري لـ Pouf51 mRNA في البويضتين الفوقيتين.
يمكن إجراء الفلور المناعي المتزامن للبروتين المستهدف من أجل المشاركة في توطين مرنا مع بروتين ملزم للرنا. يسمح التعريب المشترك للـ mRNAs مع بروتينات الربط الحمض النووي الريبي للمحققين بتحديد الآليات التي تنظم تخزين الحمض النووي الريبي (MRNA) والترجمة والتحلل داخل البويضة أو الجنين.
