Здравствуйте, меня зовут Бартоломео Боско, и я аспирант лаборатории транскрипционные сети в Центре интегративной биологии Университета Тренто в Италии. Как вы знаете, транскрипция является чрезвычайно сложным процессом, включающим пространственную и временную организацию транскрипционные факторы и кофактора. Большинство из них, в том числе человек P53, распознают специфические цис-действующие элементы, называемые элементами реакции, и привязка к этому секвенированию ДНК необходима для модуляции транскрипции генов-мишеней.
В этой работе, мы хотели бы показать вам протокол для изучения P53 последовательности конкретных функций трансактивации с использованием дрожжей в качестве модели системы, как белок в гене репортера цвета или люциферазы или на количественной оценки роста клеток, чтобы подчеркнуть основные экспериментальные шаги и универсальность этих подходов. Протокол первый, строительство репортер дрожжей штаммов, которые содержат конкретные P53 ответ элемент вверх по течению аденина-2 или светлячок люциферазы гена. Чтобы построить напряжение репортера, сначала следуйте шагам 1.1 до 1.15, чтобы преобразовать дрожжевые клетки с олигонуклеотидами, нацеленными на желаемый регион промоутера.
Преобразование основано на стандартном литиевом ацетат-протоколе. После того, как трансформанты появляются на 5-FOA пластин, как правило, после трех дней инкубации при 30 градусах, реплики пластины их на не селективных пластин YPDA, а также на пластинах YPDA, содержащих G418, маркировка каждой пластины для облегчения их последующего сравнения. Инкубировать тарелки на ночь при 30 градусах.
На следующий день, определить кандидата репортер штаммов из колоний, которые G418 чувствительных, но вырос на пластинах YPDA. Полоса выявленных колоний на новой пластине YPDA, чтобы получить одну колонию изолятов, и пусть они растут в течение двух дней при 30 градусах. Проверьте правильную интеграцию желаемого элемента ответа P53, выполняя реакцию PCR с условиями, упомянутыми в шаге 1.20.
Загрузите алицит продукта ПЦР на гель агарозы, чтобы проверить правильную длину ампликона до последовательности Sanger. Протокол второй, мы представляем пример того, как оценить P53 способность к трансактивации белка с использованием качественного цвета на основе аденина-2 дрожжевой анализ. Преобразование дрожжевых клеток с векторами экспрессии P53 после того же протокола на основе лития ацетата, описанного в разделе 1.
Полоса одного дрожжевого преобразования колоний, до шести на тарелку, на новой селективной пластины, и пусть они растут на ночь при 30 градусах. На следующий день, используя стерильные бархаты, реплики пластины полосы на новых селективных пластин, которые позволяют для оценки фенотипа цвета, т.е. селективные пластины, содержащие ограничение количества аденина.
Инкубировать при 30 градусах в течение трех дней. Те же полосы могут быть реплики покрытием несколько раз. Протокол 3, мы теперь представляем пример оценки способности трансактивации протеина P53 используя количественный люминесценции-основанный анализ дрожжей LUC1.
Во-первых, трансформировать дрожжевые клетки с векторами экспрессии P53, следуя, опять же, протоколу на основе лития ацетата, описанного во втором разделе. Патч одиночных трансформаторов на новых селективных пластин, содержащих глюкозу в качестве источника углерода, и пусть они растут на 30 градусов в одночасье. Для каждого типа преобразования сделайте пять-семь различных патчей.
После ночного роста, повторное использование небольшого количества клеток с помощью стерильной зубочистки или наконечник пипетки в синтетической селективной среде, содержащей раффинозу в качестве источника углерода. Эти клеточные суспензии должны иметь оптическую плотность на 600 нанометров около 0,4, а затем могут быть разделены на несколько пластин 96-колодец для инкубации при различных температурах, лечения, или подвергать клетки различное количество галактозы для активации P53 выражения. Для измерения активности репортера светлячка перенесите от 10 до 20 микролитров клеточной подвески из прозрачной пластины 96-колодец в белую пластину 384-колодец и смешайте клетки с равным объемом буфера лиза, инкубационный в течение 10, 15 минут при комнатной температуре на шейкере.
Добавьте 10, 20 микролитров подложки светлячков люциферазы. И измеряйте световые блоки с помощью многояблошьного считыватель пластин. Измерьте также оптическую плотность культур в плите 96-хорошо.
Протокол 4, мы теперь представляем пример того, как использовать ингибирование роста дрожжей, вызванных P53. Преобразуйте дрожжевые клетки с векторами экспрессии P53 или сотрансформируете их векторами экспрессии для coexpress P53 и одного из его кофакторов, таких как MDM2, следуя, опять же, протоколу на основе литиевого ацетата, описанного в первой части. Выращиваем трансформантные клетки в селективной среде примерно до одной оптической плотности.
И разбавить их до 0,05, и добавить выбранную молекулу в соответствующую концентрацию. Инкубировать клетки при 30 градусах на шейкере в течение 42 часов. Затем семя 100 микролитров дрожжевой клеточной культуры в минимальных селективных средних пластин.
Инкубировать в течение двух дней при 30 градусах. Правильная интеграция RE вместо кассеты ICORE может быть проверить колонией PCR, начиная с небольшого количества клеток от клонов дрожжей-кандидатов и используя грунтовки, описанные в таблице три, чтобы усилить целевой локус. Продукты ПЦР, группа из около 500 нуклеотидов, могут быть проверены секвенированием Sanger для подтверждения последовательности отредактированного геномного местоположения на наличие правильной последовательности элементов ответа P53.
Напряжение репортера готово к использованию в функциональных анализах. Чтобы оценить способность P53 к трансактивации белка, проверьте цвет дрожжевых колоний. Например, мы представляем сравнение между диким типом P53 и мутантами R175H и R282W с использованием двух различных репортеров, P21-5-prime и PUMA, и двух различных температур, 30 градусов и 37 градусов.
Интересно, что в то время как R175H является потеря функции P53 аллель, красные колонии во всех условиях, R282W показывает чувствительность температуры с остаточной активности трансактивации на 30 градусов, в результате чего белые колонии, но потеря активности на 37 градусов, в результате чего красные или розовые колонии. Расширенный набор данных представлен на рисунке два B.Wild типа P53 в четырех мутантных аллелей были протестированы на трансактивации с использованием 10 различных P53 ответ элемент репортер штаммов, три температуры, и составные уровни выражения. Результаты суммируются в цветовом коде, который напоминает фенотип цвета дрожжевой колонии.
Мутантный аллель P53 K139E сохраняет частичную активность и является холодочувствительным. Например, колонии красные в gadD45 репортер штамма на 24 и 30 градусов, но они белые при 37 градусов. Здесь мы представляем пример результатов, полученных с помощью этого метода, сравнивая трансактивацию специфичности человеческих и C.elegans P53 дрожжей.
Результаты на графике бар выражаются как средние относительные световые единицы со стандартной погрешностью в четыре репликации. Были сопоставлены пять различных элементов реагирования P53. Три различных уровня экспрессии белка P53 были протестированы путем изменения концентрации галактозы в среде.
Два ортолога P53 показывают заметно различную специфику трансактивации. Об этом свидетельствуют результаты с элементами ответа ced13 и V1, которые имеют одинаковую последовательность, за исключением наличия или отсутствия 28-нуклеотидного промека. Человек P53 экспонатов гораздо выше трансактивации с V1 связывания сайта, в то время как C.elegans P53 показывает обратное.
Результаты не зависит от уровня экспрессии P53 при галактозе-необремом промоутере. Измерьте рост дрожжей, подсчитав количество колоний, полученных в 100 микролитров культуры капель. Рассчитайте эффект реактивации мутантов соединений, учитывая рост диких P53, выражаюющих дрожжи, как максимально возможный эффект, установленный на 100%, в то время как рост клеток, выражаюющих мутант P53, представляет собой нулевой уровень реактивации.
В этом примере Nutlin-3a снимает ингибирование P53 дикого типа, вызванное коэкспрессией MDM2, в то время как PhiKan083 частично активирует мутант Y220C P53. В обоих случаях это приводит к P53-зависимому снижению роста дрожжей. Дрожжи базальных клеток оказались полезными для исследования значений, аспектов функций белка P53.
Протокол, описанный в этой работе, особенно чувствителен для оценки потенциала трансактивации дикого типа или связанного с раком мутанта P53 к вариантам целевых объектов. Кроме того, этот подход может быть использован для выявления малых молекул, влияющих на функции P53, и для изучения взаимодействия P53 с кофактором. Использование цветных репортеров, миниатюризация люциферазы, а также тест на ингибирование роста приводят к экономически эффективным и масштабируемым анализам, потенциально подотнозвимым для химического библиотечного скрининга.
Наконец, система, описанная в этой работе, может быть легко принята с изучением других факторов транскрипции, специфичных для последовательности.
