مرحبا، اسمي بارتولوميو بوسكو، وأنا طالب دكتوراه في مختبر الشبكة النسخية في مركز البيولوجيا التكاملية في جامعة ترينتو في إيطاليا. كما تعلمون، النسخ هو عملية معقدة للغاية تنطوي على تنظيم المكانية والزمانية من عامل النسخ والمحسن. معظمها، بما في ذلك P53 الإنسان، تعترف عناصر محددة رابطة الدول المستقلة بالنيابة، وتسمى عناصر الاستجابة، وملزمة على هذا التسلسل الحمض النووي مطلوب لتعديل النسخ من الجينات المستهدفة.
في هذا العمل، نود أن تظهر لك بروتوكول لدراسة P53 تسلسل محددة في وظائف transactivation باستخدام الخميرة كنظام نموذج كبروتين في جين مراسل اللون أو luciferase أو على الكم من نمو الخلايا لتسليط الضوء على الخطوات التجريبية الرئيسية وبراعة هذه النهج. البروتوكول الأول، بناء سلالات الخميرة مراسل التي تحتوي على عنصر استجابة P53 محددة المنبع من adenine-2 أو الجين luciferase اليراعات. لبناء سلالة مراسل، اتبع أولا الخطوات 1.1 من خلال 1.15 لتحويل خلايا الخميرة مع oligonucleotides تستهدف المنطقة المروج المطلوب.
ويستند التحول على بروتوكول الليثيوم القياسية القائمة على خلات. مرة واحدة تظهر المحولات على لوحات 5-FOA، وعادة بعد ثلاثة أيام من الحضانة في 30 درجة، طبق النسخة المتماثلة لهم على لوحات YPDA غير انتقائية وأيضا على لوحات YPDA التي تحتوي على G418، ووضع علامات كل لوحة لتسهيل المقارنة اللاحقة. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 30 درجة.
في اليوم التالي، حدد سلالات المراسل المرشح من المستعمرات الحساسة G418 ولكنها نمت على لوحات YPDA. خط المستعمرات التي تم تحديدها على لوحة YPDA جديدة للحصول على عزل مستعمرة واحدة ، والسماح لهم تنمو لمدة يومين في 30 درجة. تحقق من التكامل الصحيح لعنصر الاستجابة P53 المطلوب، تنفيذ تفاعل PCR مع الشروط المذكورة في الخطوة 1.20.
تحميل aliquot من المنتج PCR على هلام agarose للتحقق من طول أمبيركون الصحيح قبل تسلسل سانجر. البروتوكول الثاني، نقدم مثالا على كيفية تقييم P53 قدرة تنشيط البروتين باستخدام نوعية اللون القائم على المقايسة الخميرة أدينين-2. تحويل خلايا الخميرة مع ناقلات التعبير P53 بعد نفس بروتوكول الليثيوم القائم على خلات الموصوفة في القسم الأول.
مستعمرات محولة خميرة واحدة متتالية، تصل إلى ستة لكل لوحة، على طبق انتقائي جديد، والسماح لهم بالنمو بين عشية وضحاها عند 30 درجة. في اليوم التالي، وذلك باستخدام المخمل العقيمة، طبق طبق المتماثلة الشرائط على لوحات انتقائية جديدة تسمح لتقييم النمط الظاهري اللون، أي لوحات انتقائية تحتوي على كمية محدودة من أدينين.
احتضان في 30 درجة لمدة ثلاثة أيام. يمكن أن تكون نفس الشرائط طبقنة طبق الأصل عدة مرات. البروتوكول الثالث، ونحن الآن تقديم مثال على تقييم P53 قدرة تنشيط البروتين باستخدام المقايسة الخميرة LUC1 الإنارة الكمية القائمة.
أولاً، تحويل خلايا الخميرة مع ناقلات التعبير P53 التالية، مرة أخرى، بروتوكول الليثيوم القائم على خلات الموصوفة في القسم الثاني. التصحيح التحويلات واحدة على لوحات انتقائية جديدة تحتوي على الجلوكوز كمصدر للكربون، والسماح لهم تنمو في 30 درجة بين عشية وضحاها. لكل نوع التحويل، جعل خمسة إلى سبعة بقع مختلفة.
بعد النمو بين عشية وضحاها، resuspend كمية صغيرة من الخلايا باستخدام مسواك معقمة أو تلميح ماصة في المتوسطة الانتقائية الاصطناعية التي تحتوي على رافينوز كمصدر للكربون. يجب أن يكون تعليق الخلايا هذه كثافة بصرية عند 600 نانومتر حول 0.4 ويمكن تقسيمها بعد ذلك في لوحات متعددة من 96 بئرًا للاحتضان في درجات حرارة مختلفة أو علاجات أو تعريض الخلايا إلى كمية مختلفة من galactose لتنشيط تعبير P53. لقياس نشاط مراسل اليراعة ، ونقل 10 إلى 20 ميكرولترات من تعليق الخلية من لوحة شفافة 96 جيدا في لوحة بيضاء 384 جيدا ، وخلط الخلايا مع حجم متساو من العازلة تحلل ، احتضان لمدة 10 ، 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر.
إضافة 10، 20 ميكرولترات من الركيزة لوسيفراز اليراعات. وقياس وحدات الضوء باستخدام قارئ لوحة متعددة الأطراف. قياس أيضا الكثافة البصرية للثقافات في لوحة 96-جيدا.
البروتوكول الرابع، نقدم الآن مثالاً على كيفية استغلال تثبيط نمو الخميرة الناجمة عن P53. تحويل خلايا الخميرة مع ناقلات التعبير P53، أو cotransform لهم ناقلات التعبير إلى coexpress P53 واحد من العوامل المساعدة، مثل MDM2، بعد، مرة أخرى، بروتوكول الليثيوم القائم على خلات الموصوفة في القسم الأول. تنمو الخلايا المحولة في متوسطة انتقائية إلى كثافة بصرية واحدة تقريبا.
وتمييعها إلى 0.05، وإضافة جزيء مختار إلى التركيز المناسب. احتضان الخلايا في 30 درجة على شاكر لمدة 42 ساعة. ثم، البذور 100 ميكرولترات من ثقافة خلية الخميرة في لوحات متوسطة انتقائية الحد الأدنى.
احتضان لمدة يومين في 30 درجة. يمكن التحقق من التكامل الصحيح في مجال إعادة استخدام الموارد في مكان كاسيت ICORE بواسطة PCR مستعمرة ، بدءا من كمية صغيرة من الخلايا من استنساخ الخميرة المرشحة واستخدام التمهيديات الموصوفة في الجدول الثالث لتضخيم المَسَع المستهدف. ويمكن بعد ذلك فحص منتجات PCR، وهي عبارة عن نطاق من حوالي 500 نوكليوتيدات، بواسطة تسلسل سانجر لتأكيد تسلسل الموقع الجينومي المحرر لوجود تسلسل عناصر الاستجابة P53 الصحيح.
سلالة المراسل جاهزة للاستخدام في التشايس الوظيفي. لتقييم قدرة P53 تنشيط البروتين، والتحقق من لون مستعمرات الخميرة. على سبيل المثال، نقدم مقارنة بين P53 من النوع البري وR175H وR282W المسوخ باستخدام اثنين من المراسلين مختلفة، P21-5-prime و PUMA، ودرجتين حرارة مختلفتين، 30 درجة و 37 درجة.
ومن المثير للاهتمام، في حين R175H هو فقدان وظيفة P53 أليل، المستعمرات الحمراء في جميع الظروف، R282W يظهر حساسية درجة الحرارة مع نشاط التواليب المتبقية في 30 درجة، مما أدى إلى مستعمرات بيضاء، ولكن فقدان النشاط في 37 درجة، مما أدى إلى المستعمرات الحمراء أو الوردية. يتم عرض مجموعة بيانات موسعة في الشكل الثاني B.Wild من نوع P53 في أربعة أليل متحولة تم اختبارها من أجل تنشيطها باستخدام 10 سلالات مراسل عنصر استجابة P53 مختلفة ، وثلاث درجات حرارة ، ومستويات التعبير التأسيسي. يتم تلخيص النتائج في رمز اللون الذي يذكر نمط ظاهري اللون مستعمرة الخميرة.
تحتفظ أليل متحولة P53 K139E بنشاط جزئي وهي حساسة للبرد. على سبيل المثال، المستعمرات حمراء في سلالة مراسل GADD45 في 24 و 30 درجة، لكنها بيضاء في 37 درجة. هنا، نقدم مثالا للنتائج التي تم الحصول عليها مع هذه الطريقة، مقارنة خصوصية transactivation من الخميرة الإنسان وC.elegans P53.
يتم التعبير عن النتائج في الرسم البياني الشريطي على أنها وحدات إضاءة نسبية متوسطة مع خطأ قياسي من أربعة نسخ متماثلة. وقورنت خمسة عناصر مختلفة للاستجابة من نوع P53. تم اختبار ثلاثة مستويات مختلفة من التعبير البروتين P53 من خلال تغيير تركيز جالاكتوز في الوسط.
تظهر تقويمات P53 اثنين خصوصية مختلفة بشكل ملحوظ. ويتجلى ذلك في النتائج مع عناصر استجابة ced13 وV1 التي تشترك في نفس التسلسل، باستثناء وجود أو عدم وجود 28-نوكلييوتيدات الفضاء. يسلك P53 الإنسان أكثر من ذلك بكثير transactivation مع موقع الربط V1، في حين C.elegans P53 يظهر العكس.
النتائج مستقلة عن مستوى التعبير P53 تحت المروج galactose غير قابل للتكبوس. قياس نمو الخميرة من خلال عد عدد المستعمرات التي تم الحصول عليها في 100 microliters الثقافة قطرات. حساب تأثير إعادة تنشيط متحولة من المركبات النظر في نمو البرية من نوع P53 التعبير عن الخميرة باعتبارها أقصى تأثير ممكن، تعيين إلى 100٪، في حين أن نمو الخلايا التي تعبر عن P53 متحولة تمثل مستوى صفر من إعادة التنشيط.
في هذا المثال، ينولين-3a يخفف من تثبيط P53 من نوع البرية الناجمة عن coexpression MDM2، في حين PhiKan083 جزئيا إعادة تنشيط Y220C P53 متحولة. في كلتا الحالتين، وهذا يؤدي إلى انخفاض P53 تعتمد على نمو الخميرة. وقد أثبتت الخلايا القاعدية الخميرة مفيدة للتحقيق في القيم, جوانب وظائف البروتين P53.
البروتوكول الموصوف في هذا العمل حساس بشكل خاص لتقييم إمكانية التنشيط من النوع البري أو المرتبط بالسرطان متحولة P53 إلى المتغيرات من المواقع المستهدفة. علاوة على ذلك، يمكن استخدام هذا النهج لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تؤثر على وظائف P53 ودراسة التفاعل P53 مع العوامل المساعدة. استخدام المراسلين اللون، ومصغرة من لوسيفراز، فضلا عن نتيجة اختبار تثبيط النمو في فعالة من حيث التكلفة وقابلة للتطوير المقايسة يحتمل أن تكون قابلة لفحص المكتبة الكيميائية.
وأخيراً، يمكن بسهولة اعتماد النظام الموصوف في هذا العمل بدراسة عوامل نسخ أخرى خاصة بالتسلسل.
