קשה לחקור את המיקרו-וירוס של הגידול בשל מורכבותו. פיתחנו מיקרו-וירוסים מיקרו-וירוסים המורכבים ממיקרו-וירוסים קומבינטוריים פשוטים המאפשרים זיהוי של מניעים עיקריים של פנוטיפים של תאי הגידול. היתרון העיקרי של פלטפורמת MEMA הוא כי בגלל תנאי microenvironment מוגדרים כל, זה פשוט לזהות גורמי microenvironment המניעים פנוטיפים של עניין.
פלטפורמת MEMA ישימה באופן נרחב במערכות אחרות שאינן סרטן, כולל זני תאים ראשוניים ותאי גזע. ישנם מספר טריקים הנדסיים וצעדים שפיתחנו כדי להאיץ את עבודת הספסל הרטוב ולפשט את הפרוטוקול. כדי להתחיל, השתמש במדפסת סיכות מגע כדי להדפיס תערובת הדפסה של מטריצה חוץ-תאית בנקודות נאמנות לתוך לוחות שמונה בארות.
השתמש בפינים בקוטר 350 מיקרומטר המסודרים בתצורת ראש הדפסה של ארבע פעמים ושבע כדי להדפיס את המטריצה החוץ-תאית עבור המיקרו-מיקרו-סרטנים של המיקרו-וירוס. בלוק הקולגן מודפס על MEMAs כרשתות. בארות PBS מלאות מספקות לחות נוספת כדי למנוע התייבשות מתוך צלחת המקור של תערובת ההדפסה של מטריצה חוץ-תאית.
הדפס את המערכים ב- 8 בארות כ- 20 עמודות על 35 שורות, בסך הכל 700 נקודות. לאחר ההדפסה, יש לאחסן לוחות ב-desiccator למשך שלושה ימים לפחות לפני השימוש. ראשית, לעצב פריסת צלחת 96 היטב עם ריווח המאפשר שימוש פיפטה רב ערוצית עם ארבעה טיפים במרווחים, כך הטיפול של צלחות MEMA רבות ניתן לעשות בבת אחת.
ואז לאחזר את ligands מהמקפיא, ולהפשיר בקרח ברדס זרימה למינארית. בקצרה להעיף ולסובב למטה כל צינור. השתמש במאגר המומלץ של היצרן כדי לדלל את הליגנדים למלאי עובד 200 פעמים.
פיפטה 10 מיקרוליטרים של כל מניית לינד 200 פעמים לתוך באר המתאימה בתוך צלחת 96 באר. השתמש בסרט איטום כדי לאטום את הצלחות ולאחסן אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס. הפוך לוחות טיפול ליגנד בקבוצות, וללכוד את כל המטה-נתונים לניתוח במורד הזרם.
לפני culturing תאים, לחסום את MEMAs עם שני מיליליטר ל הבאר של חיץ חסימה nonfouling במשך 20 דקות. השתמש מפצל Y עם שתי פיפטים פסטר כדי לשאפת את חוצץ חסימה בארות מרובות בבת אחת, ולאחר מכן לשטוף משולשת את בארות עם PBS. כדי למנוע ייעוד, להשאיר את הנפח הסופי של PBS בארות עד מוכן ציפוי תא.
לפני ניסוי MEMA מלא, לייעל את ריכוז זריעת תא MCF7 על ידי ביצוע ניסוי טיטריות התא. נקודה אידיאלית, כפי שמוצג כאן, יש מספיק מספרי תאים כדי לחלץ נתונים, אבל לא כל כך הרבה כי המקום הוא confluent יתר על מדי. ב- MEMA, שאפו את תאי ה- PBS והזרעים הנותרים MCF7 ב- 30, 000 עד 35, 000 תאים ל באר בשני מיליליטר של מדיום זריעה.
מניחים את ה-MEMA באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר הידבקות לילה באינקובטור, שאפו את המדיום והחלפו בשני מיליליטר של מדיום צמיחה מופחת כדי לבודד את ההשפעה המריצה של ליגנדים ספציפיים. ואז להפשיר צלחת טיפול ליגנד קפואה בעבר על קרח.
צלחת מופשרת צנטריפוגה ב 200 פעמים g לדקה אחת. מעבירים 200 מיקרוליטרים של מדיום מכל באר בצלחת התרבות MEMA ל באר המתאימה בצלחת הטיפול בליגה. פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב את הליגנד עם המדיום, ולהעביר את התערובת בחזרה ל באר המתאימה בצלחת התרבות MEMA.
התנדנדו קלות ביד והחזירו את צלחות ה-MEMA לאנקובטור כדי לתרבת את שילוב הליגנד-ECM ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. לאחר 71 שעות, להוסיף 100 פעמים EdU ל בארות MEMA עבור ריכוז סופי של 10 micromolar. דגירה זה עוד שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.
לאחר הדגירה הסופית, שאפו את בארות. תקן MEMAs בשני מיליליטר ל באר של 2% PFA במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. ואז שאף את PFA מה בארות.
Permeabilize עם שני מיליליטר לבא של 0.1% חומר שטח לא יוני במשך 15 דקות. שאפו את חומר הגלישה, ולאחר מכן שטפו את בארות עם שני מיליליטר של PBS ו- PBS-T, ברצף. לאחר מכן, להוסיף 1.5 מיליליטר של ריאגנטים תגובת זיהוי EdU לכל באר.
דגירה במשך שעה בטמפרטורת החדר, נדנדה מוגן מפני אור. לאחר מכן מרווה את התגובה עם חיץ מרווה מסחרי 1.5 מיליליטר ל הבאר. שאפו שוב, ושטפו עם PBS-T לפני הדגירה עם ריכוזים אופטימליים של כתמים או נוגדנים.
דגירה בארות MEMA עם נוגדנים ראשוניים חיץ כתמים, נדנדה בארבע מעלות צלזיוס לילה. בעקבות דגירה נוגדנים ראשונית, לשטוף בארות עם PBS ואחריו PBS-T. הוסף נוגדנים משניים ב- 0.5 מיקרוגרם ל- DAPI מיליליטר, מדולל במאגר כתמים.
דגירה, נדנדה במשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך. לשטוף בארות פעמיים עם שני מיליליטר לכל באר של PBS, ולהשאיר אותם בשני המיליליטרים האחרונים של PBS. כדי לדמיין MEMA מוכתם, מקם אותו על שלב המיקרוסקופ של מערכת הדמיה אוטומטית עם ערוצי זיהוי פלואורסצנטיים מתאימים.
פלט נתוני תמונה המתקבלים למערכת ניהול תמונה. פלח תאים וחשב רמות עוצמה באמצעות CellProfiler. בפרוטוקול זה, פרופילי מחזור תאים של ערכי עוצמת DAPI מסוכפלים לעומת ספירת תאים מצלחת אחת בת שמונה בארות מציינים תאים בשלב G1 לעומת מחזור תא G2.
זה מתאים לשני תוכן nDNA בתאים בשלב הצמיחה המוקדמת, וארבעה תוכן nDNA בתאים עומד לעבור מיטוזה. ההשפעה של microenvironment של ליגנדים ו ECM על מספר התא והן על שילוב EdU מוצגת. אדום מציין מספר תא גבוה יותר וכחול הוא מספר תא נמוך יותר.
רבים מההשפעות מונחות ליגנד, שכן מצב ECM לא השפיע מאוד על מספר התא או על החיוביות של EdU. Natagen 1 הוא יוצא מן הכלל ברור, כמו נוכחות של מולקולת ECM זה מעכב מחייב תאים וצמיחה של MCF7. ליגנדים כגון FGF6 ו neuregulin-1 אלפא לשפר את מספר התא ויש להם שיעור גבוה של התא שילוב EdU, בעוד ligands כגון אמפירגלין ו neuregulin-1 SMDF לעכב איגוד תאים וצמיחה של תאים.
דוגמה לתאי MCF7 הגדלים במקום MEMA שטופלו באלפא neuregulin-1 מראה שיעורים גבוהים של התאגדות EdU, המצוין על ידי גרעינים ורודים. בתמונה זו, הכתם הירוק הוא מסיכת תא, וכחול הוא DAPI. מכיוון שניסוי MEMA מלא הוא יקר, חשוב מאוד לבצע שלבי אופטימיזציה, כגון גירויים בתאים ובנסיובים, לפני ביצוע הניסוי המלא.
לאחר שזוהו תנאי עניין מיקרו-ויראליים באמצעות פלטפורמת MEMA, ניתן ללמוד את הליגנדים הספציפיים וחלבוני המטריצה החוץ-תאיים לעומק באמצעות מערכות מסורתיות לתרבות תאים 2D ו- 3D.
