종양 미세 환경을 연구하는 것은 그것의 복잡성 때문에 어렵습니다. 우리는 종양 세포 표현형의 주요 동인의 식별을 허용하는 간단한 조합소 미세 환경으로 구성된 마이크로 환경 마이크로 어레이를 개발했습니다. MEMA 플랫폼의 주요 장점은 마이크로 환경 조건이 모두 정의되어 있기 때문에 표현형을 유도하는 미세 환경 요인을 식별하는 것이 간단하다는 것입니다.
MEMA 플랫폼은 1 차세포 긴장 및 줄기 세포를 포함하여 그밖 비암 시스템에서 넓게 적용됩니다. 우리가 젖은 벤치 작업을 가속화하고 프로토콜을 단순화하기 위해 개발 한 엔지니어링 트릭과 단계의 숫자가 있습니다. 먼저 터치 핀 프린터를 사용하여 세포외 매트릭스 인쇄 혼합물을 수호 반점에 8웰 플레이트로 인쇄합니다.
4회 7회 인쇄 헤드 구성으로 배열된 350마이크로미터 직경 핀을 사용하여 마이크로환경 마이크로어레이용 세포외 매트릭스를 인쇄합니다. 콜라겐 블록은 MEMA에 그리드로 인쇄됩니다. PBS가 채워진 우물은 세포외 매트릭스 인쇄 혼합물 소스 플레이트에서 건조되는 것을 방지하기 위해 여분의 습도를 제공합니다.
총 700개의 스팟에 대해 8개의 잘 플레이트에 배열을 20열로 35열로 인쇄합니다. 인쇄 후, 사용하기 전에 최소 3 일 동안 건조기에 접시를 저장합니다. 먼저, 간격이 있는 96웰 플레이트 레이아웃을 설계하여 4개의 간격이 있는 팁으로 멀티 채널 파이펫을 사용할 수 있으므로 많은 MEMA 플레이트의 처리를 한 번에 수행할 수 있습니다.
그런 다음 냉동고에서 리간드를 검색하고 라미나르 플로우 후드에서 얼음으로 해동합니다. 간단히 플릭하고 각 튜브를 아래로 회전. 제조업체의 권장 버퍼를 사용하여 리간드를 200배의 작업 재고로 희석합니다.
파이펫 10 마이크로리터각 200배 리간드 스톡은 96웰 플레이트 내에 해당 우물로 들어갑니다. 밀봉 필름을 사용하여 접시를 밀봉하고 섭씨 영하 20도에 보관하십시오. 리간드 처리 플레이트를 일괄 처리로 만들고 다운스트림 분석을 위해 모든 메타데이터를 캡처합니다.
세포를 배양하기 전에 20분 동안 비오염 차단 버퍼당 2밀리리터로 MEMEA를 차단합니다. 두 개의 파스퇴르 파이펫이 있는 Y 스플리터를 사용하여 한 번에 여러 우물에서 블로킹 버퍼를 흡인한 다음 PBS로 우물을 세 배로 세척합니다. 탈수를 방지하기 위해 세포 도금이 준비될 때까지 PBS의 최종 부피를 우물에 둡니다.
전체 MEMA 실험 전에, 세포 적정 실험을 수행 하여 MCF7 세포 파종 농도를 최적화. 여기에 표시된 바와 같이 이상적인 스팟은 데이터를 추출하기에 충분한 셀 번호가 있지만 그 자리가 지나치게 혼잡할 수는 없습니다. MEMA에서, 나머지 PBS 및 종자 MCF7 세포를 30, 000 에서 35, 000 세포마다 파종 배지의 2 밀리리터에서 잘 흡입한다.
MEMA를 인큐베이터에 섭씨 37도에 놓습니다. 인큐베이터에서 하룻밤 동안 유착 후, 배지를 흡인하고 특정 리간드의 자극적 영향을 격리하기 위해 감소된 성장 매체의 2밀리리터로 대체한다. 그런 다음 얼음에 이전에 냉동 리간드 처리 플레이트를 해동.
원심분리기는 1분 동안 200배 g의 플레이트를 해동시켰습니다. MEMA 배양 플레이트내의 각 우물에서 리간드 처리 플레이트에 적합한 우물로 200마이크로리터의 배지를 전달한다. 파이펫은 리간드를 매체와 혼합하고, 이 혼합물을 MEMA 배양판에서 적절한 우물로 다시 옮기위해 위아래로 한다.
가볍게 손으로 바위와 37섭씨와 5 %의 이산화탄소에서 리간드 - ECM 조합을 배양하기 위해 인큐베이터에 MEMA 플레이트를 반환합니다. 71시간 후, 10 마이크로몰러의 최종 농도를 위해 MEMA 우물에 100회 EdU를 추가합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 1시간 더 인큐베이션을 사용한다.
최종 인큐베이션 후, 우물을 흡인. 실온에서 15분 동안 2%의 PFA의 2밀리리터로 MEMEA를 수정합니다. 그런 다음 우물에서 PFA를 흡입합니다.
15분 동안 0.1%의 니어계면활성제의 2밀리리터로 퍼메라빌리화합니다. 계면 활성제를 흡인한 다음 PBS 및 PBS-T의 2 밀리리터로 우물을 순차적으로 세척합니다. 그 후, 각 웰에 EdU 검출 반응 시약의 1.5 밀리리터를 추가합니다.
실온에서 1시간 동안 배양하고, 흔들리고, 빛으로부터 보호합니다. 그런 다음 1.5 밀리리터 상용 담금질 버퍼로 반응을 잘 담금질합니다. 다시 흡인, 얼룩 또는 항체의 최적화 된 농도로 배양하기 전에 PBS-T로 세척.
밤새 섭씨 4도에서 흔들면서, 염색 완충제에서 1 차적인 항체와 MEMA 우물을 배양합니다. 1 차적인 항체 잠복에 따라 PBS로 우물을 씻고 PBS-T가 뒤따릅니다. 염색 버퍼에서 희석된 밀리리터 DAPI당 0.5 마이크로그램에 이차 항체를 추가합니다.
인큐베이션, 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 흔들. PBS의 우물 당 두 밀리리터로 우물을 두 번 세척하고 PBS의 마지막 두 밀리리터에 둡니다. 염색된 MEMA를 이미지화하려면 적절한 형광 검출 채널을 갖춘 자동화된 이미징 시스템의 현미경 단계에 배치합니다.
결과 이미지 데이터를 이미지 관리 시스템에 출력합니다. 셀 프로파일러를 사용하여 셀을 세그먼트및 강도 수준을 계산합니다. 이 프로토콜에서, 1개의 8웰 플레이트에서 세포 수 대 binned DAPI 강도 값의 세포 주기 프로파일은 G1에 있는 세포를 G2 세포 주기 단계 대 나타냅니다.
이것은 초기 성장 단계에서 세포에 있는 2개의 nDNA 함량및 미토시스를 겪기 위하여 세포에 있는 4개의 nDNA 내용에 해당합니다. 리간드및 ECM의 미세환경이 세포수와 EdU 통합 모두에 미치는 영향이 나타났다. 빨간색은 셀 수가 높고 파란색은 셀 수가 더 낮습니다.
많은 효과는 ECM 조건이 세포 수 또는 EdU 양성에 강하게 영향을 미치지 않았기 때문에 리간드 구동됩니다. Natagen 1은 이러한 ECM 분자의 존재가 MCF7의 세포 결합 및 성장을 억제하기 때문에 명확한 예외입니다. FGF6 및 neuregulin-1 알파와 같은 리간드세포는 세포 수를 향상시키고 EdU 통합의 높은 비율을 가지며, 암파이어굴린 및 중성조절-1 SMDF와 같은 리간드는 세포 결합 및 세포의 성장을 억제합니다.
중성구-1 알파로 치료된 MEMA 지점에서 성장하는 MCF7 세포의 예는 분홍색 핵에 의해 표시된 EdU 정산의 높은 비율을 나타낸다. 이 이미지에서 녹색 얼룩은 셀 마스크이고 파란색은 DAPI입니다. 전체 MEMA 실험은 비용이 많이 들기 때문에 전체 실험을 수행하기 전에 세포 및 혈청 적정과 같은 최적화 단계를 수행하는 것이 매우 중요합니다.
MEMA 플랫폼을 사용하여 미세 환경적 조건이 확인되면, 특정 리간드 및 세포외 매트릭스 단백질은 전통적인 2D 및 3D 세포 배양 시스템을 사용하여 보다 심층적인 것으로 연구될 수 있다.
