Современные цымографические методы обнаруживают ограниченное количество протеаз. Флуоресцентная пептидная симография использует флуоресцентные пептиды в качестве разлагаемого субстрата, позволяющего измерять больший спектр протеаз. Основным преимуществом этого метода является модульная конструкция.
Последовательность флуоресцентного пептида определяет, какие протеи обнаруживаются и флуоресцентный пептид можно легко поменять с пептидом другой последовательности, способностью обнаруживать другие протеи. Этот метод может помочь информировать дизайн пептидов 'использования в качестве разлагаемых перекрестных связей в инженерии биоматериалов, таких как те, которые используются для доставки наркотиков или тканевой инженерии приложений. Включение этого пептида в этот метод может определить ткани выделяется протеасы, которые отвечают за деградацию биоматериала.
Демонстрация этого метода важна для визуализации многослойного подхода, который уникален по сравнению с другими методами цымографии. Демонстрацией этой техники будет Амейя Дешмух, аспирант моей лаборатории. Для начала подготовьте 10%-ный полиакриламид, разрешающий гель-решение, изложенное в таблице одного из текстовых протоколов.
Непосредственно перед заливкой геля добавьте TEMED и APS. Затем заполните и опорожните 1,5-миллиметровую мини-гелевую кассету на полпути растворяемым гелем. Добавить тонкий слой изопропанола в верхней части полиакриламинидного геля для получения уровня геля и предотвращения пузырьков.
Используйте оставшийся раствор полиакриламинида для отслеживания прогресса реакции полимеризации. Когда полиакриламид в трубке полностью затвердев, реакция завершена. В то время как первый разрешающий слой геля полимеризируется, извлекайте комплект Azido-PEG3-Maleimide из хранилища при температуре 20 градусов по Цельсию и позвольте компонентам достичь комнатной температуры.
Затем растворите компоненты флакона 2 в рекомендуемом производителем объеме DMSO. И вихрь в течение 30 секунд, чтобы обеспечить жидкости хорошо перемешаются. Перенесите содержимое флакона в чистую сухую 100-миллилетную круглую нижнюю колбу, которая содержит бар для перемешивания.
Немедленно вставьте резиновую пробку перегородки с диафрагмой, которую можно проколоть шприцем в рот колбы. Затем вставьте две шприц-иглы 18-го калибра в диафрагму. Соедините одну из игл шприца с инертным газовым баллоном и дайте газу заполнить круглую нижнюю колбу в течение трех минут.
Затем выключите инертный газ и отсоедините его от иглы. Используя шприц, ввимите полное содержимое флакона два в колбу. Удалите обе иглы и шприц.
Разрешить компоненты смешивать в течение 30 минут при комнатной температуре при перемешивании. После этого удалите резиновую пробку перегородки и перенесите содержимое в чистую пятими миллилитровую центрифугу. После того, как первый разрешающий слой геля полимеризован, слейте слой изопропанола.
Труба один миллилитр деионизированной воды на вершине геля, а затем залить водой, чтобы промыть гель. Извлекит функционализированный флуоресцентный пептид из хранилища при 80 градусах Цельсия. Дайте ему оттаять при комнатной температуре.
Подготовь 10%-разрешающий гель раствор, содержащий молекулу связующим звеном Azido-PEG3-Maleimide и флуоресцентный пептид, изложенный в таблице одного из текстовых протоколов. Непосредственно перед заливкой гель добавляют TMED и APS. Затем заполните половину оставшейся части гелеобразной кассеты раствором геля пептида.
Добавить тонкий слой изопропанола в верхней части полиакриламинидного геля для получения уровня геля и предотвращения пузырьков. Используйте оставшийся раствор полиакриламинида для отслеживания прогресса реакции полимеризации. После завершения реакции слейте слой изопропанола.
Труба один миллилитр деионизированной воды на вершине геля, а затем залить водой, чтобы промыть гель. Если не использовать гели немедленно, хранить их, погружая их в пластиковую коробку, наполненную 100 миллилитров 1x PBS при четырех градусах по Цельсию. Оберните коробку в алюминиевую фольгу, чтобы предотвратить фотоотверга.
Во-первых, подготовь решение для геля на 5%, как указано в таблице одного из текстовых протоколов. Непосредственно перед заливкой гель добавляют TMED и APS. Заполните оставшуюся пустую часть кассеты с гелем для укладки.
Быстро вставьте гребень геля 1,5 миллиметра в слой укладки геля убедившись, что пузырьки остаются в ловушке под колодцами. Используйте оставшийся раствор полиакриламинида для отслеживания прогресса реакции полимеризации. Когда реакция будет завершена, аккуратно удалите гребень и ленту из задней части кассеты с гелем.
Для начала растворите образцы в обычном буфере образца цымографии. Добавьте 400 миллилитров os 1X tris glycene SDS бегущий буфер к гелевому аппарату. Загрузите до 35 микролитров образца на колодец.
Вы запустите образцы на 120 вольт при четырех градусах По Цельсию в течение полутора часов или до тех пор, пока молекулярные стандарты веса не укажут, что протеасы, представляющие интерес, находятся в пептидно-разрешаемом слое геля. После этого снимите гели с пластиковой кассеты. Вымойте гели три раза в буфере при комнатной температуре под нежным возбуждением.
С каждой стиркой, продолжительностью 10 минут. Перенесите гели в развивающийся буферный раствор на 15 минут. Затем замените раствор свежим развивающимся буфером и инкубировать при 37 градусах Цельсия под нежным возбуждением в течение 24 часов.
После этого используйте флуоресцентный гель сканер imager с соответствующим возбуждением и выбросов фильтры для изображения гелей. В этом исследовании флуоресцентные разлагаемые пептиды протеазы включаются в полиакриламидные гели. ЗГИВ является коллагена один производные последовательности, предназначенные для обнаружения клеточного коллагенеза, в то время как LACW является последовательность, которая была оптимизирована для обнаружения MMP-14 и MMP-11.
Флуоресцентные изображения показывает многочисленные полосы в пептидных гелях LACW, в то время как только одна полоса замечена в гелях ОГИВ. По сравнению с желатиновой цыпографией, гели LACW способны обнаруживать больше протеолитических полос, что демонстрирует способность пептидной цымографии обнаруживать более широкий спектр протеаз, присутствующих в биологических образцах, чем традиционные методы с использованием местных субстратов. Пептидные цымографические клетки затем инкубируется в буфер развития, содержащий либо GM6001, широкий спектр MMP-ингибитор, или E64, общий ингибитор катепсина.
Лечение пептидных гелей LACW с помощью GM6001 снижает интенсивность полос. В то время как лечение СЕ64 не имеет заметного эффекта. Лечение пептидных гелей ГИЗ с GM6001 приводит к полной абляции ранее замеченных полос.
В то время как E64 не имеет никакого эффекта. Гимография желатина проводится с использованием очищенной, активированной MMP-9 для сравнения чувствительности пептидной цыпографии с действующим золотым стандартом. Гели LACW способны обнаруживать малейший концентраций MMP-9.
Протеи требуют особых условий для повторной природы и активации. Тщательно подготовьте буферные решения, чтобы убедиться, что состав и PH являются правильными. Этот метод может быть дополнен существующими методами проверки личности и проведения дальнейшего анализа измеренных протеаз.
Это включает в себя западные blotting, в режиме реального времени ПЦР, и масс-спектрометрии. Будьте осторожны при обращении с полиакриламинидом. Неполимеризованное решение считается мощным нейротоксином и соответствующее средства индивидуальной защиты всегда следует носить при обращении с ним.
