Las técnicas cográficas actuales detectan un número limitado de proteasas. La zymografía péptido fluorescente utiliza péptidos fluorescentes como sustrato degradable que permite medir una mayor gama de proteasas. La principal ventaja de este método es su diseño modular.
La secuencia del péptido fluorescente determina qué proteasas se detectan y el péptido fluorescente se puede intercambiar fácilmente con un péptido de una secuencia diferente, una capacidad para detectar otras proteasas. Esta técnica puede ayudar a informar el diseño del uso de péptidos como enlaces cruzados degradables en biomateriales de ingeniería como los utilizados para la administración de fármacos o aplicaciones de ingeniería de tejidos. La incorporación de este péptido en esta técnica puede identificar proteasas secretadas en tejido que son responsables de la degradación de los biomateriales.
La demostración de esta técnica es importante para visualizar el enfoque multicapa que es único en comparación con otras técnicas de zymography. Demostrando esta técnica será, Ameya Deshmukh, una estudiante graduada de mi laboratorio. Para empezar, prepare una solución de gel de resolución de poliacrilamida al 10% como se describe en la tabla uno del protocolo de texto.
Inmediatamente antes de verter el gel, agregue el TEMED y apS. A continuación, llene y vacíe el cassette mini gel de 1,5 milímetros a mitad de camino con la solución de gel de resolución. Añade una fina capa de isopropanol a la parte superior del gel de poliacrilamida para producir un gel de nivel y prevenir las burbujas.
Utilice la solución de poliacrilamida sobrante para realizar un seguimiento del progreso de la reacción de polimerización. Cuando la poliacrilamida del tubo se ha solidificado por completo, la reacción se ha completado. Mientras que la primera capa de gel de resolución es polimerizante, recupere el kit Azido-PEG3-Maleimide del almacenamiento a 20 grados Celsius y permita que los componentes alcancen la temperatura ambiente.
A continuación, disolver los componentes del vial dos en el volumen recomendado por el fabricante de DMSO. Y vórtice durante 30 segundos para asegurar que los líquidos estén bien mezclados. Transfiera el contenido del vial uno a un matraz inferior redondo de 100 milímetros limpio y seco que contenga una barra de agitación.
Inserte inmediatamente un tapón del tabique de goma con un diafragma que se pueda perforar con una jeringa en la boca del matraz. A continuación, inserte dos agujas de jeringa de calibre 18 en el diafragma. Conecte una de las agujas de la jeringa a un tanque de gas inerte y deje que el gas llene el matraz inferior redondo durante tres minutos.
A continuación, apague el gas inerte y desébralo de la aguja. Con una jeringa, inyecte el contenido completo del vial dos en el matraz. Retire las dos agujas y la jeringa.
Deje que los componentes se mezclen durante 30 minutos a temperatura ambiente mientras se agita. Después de esto, retire el tapón del tabique de goma y transfiera el contenido a un tubo de centrífuga limpio de cinco mililitros. Una vez que la primera capa de gel de resolución ha polimerizado verter fuera de la capa de isopropanol.
Pipetee un mililitro de agua desimasoñada en la parte superior del gel y luego vierta el agua para enjuagar el gel. Recupere el péptido fluorescente funcionalizado tiol del almacenamiento a 80 grados centígrados. Dejar que se descongele a temperatura ambiente.
Preparar una solución de gel de resolución del 10%que contenga la molécula de vinculador Azido-PEG3-Maleimida y el péptido fluorescente como se describe en la tabla uno del protocolo de texto. Inmediatamente antes de verter el gel añadir el TMED y APS. A continuación, llene la mitad de la porción restante del cassette de gel con la solución de gel de resolución de péptidos.
Añade una fina capa de isopropanol a la parte superior del gel de poliacrilamida para producir un gel de nivel y prevenir las burbujas. Utilice la solución de poliacrilamida sobrante para realizar un seguimiento del progreso de la reacción de polimerización. Una vez completada la reacción, vierta la capa de isopropanol.
Pipetee un mililitro de agua desimasoñada en la parte superior del gel y luego vierta el agua para enjuagar el gel. Si no se utilizan los geles inmediatamente, guárdelos sumergiéndolos en una caja de plástico llena de 100 mililitros de 1x PBS a cuatro grados centígrados. Envuelva la caja en papel de aluminio para evitar el fotoblancada.
En primer lugar, prepare una solución de gel de apilamiento del 5%como se describe en la tabla uno del protocolo de texto. Inmediatamente antes de verter el gel añadir el TMED y APS. Llene la porción vacía restante del cassette de gel con la solución de gel de apilamiento.
Inserte rápidamente un peine de gel de 1,5 milímetros en la capa de gel de apilamiento asegurándose de que no haya burbujas atrapadas debajo de los pozos. Utilice la solución de poliacrilamida sobrante para realizar un seguimiento del progreso de la reacción de polimerización. Una vez completada la reacción, retire suavemente el peine y la cinta de la parte posterior del cassette de gel.
Para empezar, disuelva las muestras en el tampón de muestra de zymography convencional. Añadir 400 mililitros os 1X tris glycene SDS tampón de funcionamiento al aparato de gel. Cargue hasta 35 microlitros de muestra por pozo.
Ejecute las muestras a 120 voltios a cuatro grados Celsius durante una hora y media o hasta que los estándares de peso molecular indiquen que las proteasas de interés están dentro de la capa de gel que resolu péptidos. Después de esto, retire los geles del cassette de plástico. Lave los geles tres veces en el tampón de re-naturing a temperatura ambiente bajo agitación suave.
Con cada lavado, durando 10 minutos. Transfiera los geles a una solución tampón en desarrollo durante 15 minutos. A continuación, reemplace la solución con un tampón de desarrollo fresco e incubar a 37 grados centígrados bajo agitación suave durante 24 horas.
Después de esto, utilice un escáner de gel fluorescente con los filtros de excitación y emisión adecuados para tomar imágenes de los geles. En este estudio a los péptidos degradables de la proteasa fluorescente se incorporan en geles de poliacrilamida. QGIW es una secuencia derivada de colágeno diseñada para detectar colágeno celular, mientras que LACW es una secuencia que ha sido optimizada para la detección de MMP-14 y MMP-11.
La imagen fluorescente revela numerosas bandas dentro de los geles de péptidos LACW, mientras que sólo se observa una sola banda en los geles QGIW. En comparación con la zymografía de gelatina, los geles LACW son capaces de detectar más bandas proteolíticas, lo que demuestra la capacidad de la zymografía de péptidos para detectar una gama más amplia de proteasas presentes dentro de muestras biológicas que los métodos tradicionales utilizando sustratos nativos. A continuación, las células de la cmimografía péptido se incuban en el tampón de desarrollo que contiene GM6001, un inhibidor de MMP de amplio espectro, o E64, un inhibidor general de la catepsina.
El tratamiento de los geles de péptido LACW con GM6001, disminuye la intensidad de las bandas. Mientras que el tratamiento con E64 no tiene ningún efecto discernible. El tratamiento de los geles de péptidos QGIQ con GM6001 da como resultado una ablación completa de las bandas previamente vistas.
Mientras que E64 no tiene ningún efecto. La zymografía de gelatina se lleva a cabo utilizando MMP-9 purificado y activado para comparar la sensibilidad de la zymografía de péptidos con el estándar de oro actual. Los geles LACW son capaces de detectar las concentraciones más pequeñas de MMP-9.
Las proteasas requieren condiciones específicas para re-naturaleza y se activan. Prepare cuidadosamente las soluciones de tampón para asegurarse de que la composición y el PH son correctos. Este método se puede complementar con técnicas existentes para verificar la identidad y realizar un análisis posterior de las proteasas medidas.
Esto incluye hinchazón occidental, PCR en tiempo real y espectrometría de masas. Tenga cuidado al manipular la poliacrilamida. La solución no polimerizada se considera una potente neurotoxina y siempre se debe usar un equipo de protección personal adecuado al manipularla.
