Решение структуры домена рецепторов райанодина может помочь с нашим пониманием молекулярного механизма функции белка, действия инсектицидов и развития устойчивости к инсектицидам. Эта мера подразумевает использование рентгеновской кристаллографии для иллюстрации структуры, которая считается золотым стандартом для определения структуры белка при почти атомном разрешении. Эта структура с высоким разрешением домена рецепторов насекомых ryanodine показывает механизм канала gating и обеспечивает важный шаблон для развития видов конкретных инсектицидов с использованием структуры на основе наркотиков дизайн подходов.
Как правило, люди, новые для этого метода будет бороться, потому что перспективные кристаллографы белка должны быть владеют биохимией, биофизикой, информатикой и математикой. Начните с усиления ДНК, соответствующей протеину интереса полимеразной цепной реакцией. В конце реакции, запустить все 50 микролитров реакции смеси на 2%agarose гель, и извлечь ДНК с гель извлечения комплекта в соответствии со стандартными протоколами.
Далее, linearize LIC вектор ДНК путем смешивания 20 микролитров векторной ДНК с 6 микролитров 10X буфер реакции и 4 микролитров фермента ограничения SspI в 30 микролитров двойной дистиллированной воды. Инкубировать эту реакцию смеси в течение трех часов при 37 градусов по Цельсию. В конце инкубации запустите всю смесь реакции на 1%agarose гель, а затем извлечения линейного вектора ДНК с гель извлечения комплекта в соответствии с инструкциями производителя.
Далее, выполнить отдельные T4 ДНК полимеразы лечения на 5 микролитров линейного вектора ДНК и ПЦР усиливается вставить ДНК, в соответствии со стандартными протоколами. Инкубировать в течение 40 минут при комнатной температуре, а затем 20 минут инактивации тепла фермента при температуре 75 градусов по Цельсию. Выполните реакцию на клонирование, независимую от перевязки, объединив 2 микролитера ДНК обработанных вставок T4 с 2 микролитров ДНК вектора LIC для 10-минутной инкубации при комнатной температуре.
Для преобразования BL21(DE3)E. Coli клетки с рекомбинантной плазмидой, оттаивать 50 микролитров компетентных клеток на льду, и добавить около 1 микролитера аннеалированных плазмид в трубку. Аккуратно флик трубки два-три раза, чтобы смешать клетки и ДНК, и поместить трубку обратно на лед в течение 20 минут.
В конце инкубации, тепло-шок клеток на 42 градусов по Цельсию в течение 40 секунд, а затем две минуты назад на льду. Затем добавьте один миллилитр комнатной температуры LB среды в трубку, и поместите клетки на 250 об /мин шейкер в течение 45 минут при температуре 37 градусов по Цельсию. В конце встряхивания инкубации, пластины от 150 до 200 микролитров этой смеси на выбор пластин, и инвертировать пластины на ночь при 37 градусов по Цельсию.
На следующий день, культура одной колонии в 100 миллилитров 2-YT среды, дополняется канамицин, в шейкер инкубатор при 37 градусов по Цельсию в одночасье. На следующее утро, привить один литр 2-YT среды, дополняется канамицин, с 10 миллилитров ночной культуры, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию с встряхивания до OD600 чтения достигает примерно 0,6. Затем индуцировать культуру с IPTG к окончательной концентрации 0,4 миллимолара, и расти клетки в течение пяти часов при 30 градусов по Цельсию.
В конце инкубации, урожай клеток центрифугации, и повторно приостановить гранулы до 10 граммов бактерий на 40 миллилитров концентрации буфера лиза. Нарушить стенки клеток с помощью звуковой на 65%амплитуды, и одну секунду на одну секунду, в течение восьми минут. Удалите клеточный мусор путем центрифугации.
Затем отфильтруйте супернатант, хотя 22-микрометровый фильтр, и загрузите раствор в образец цикла. Чтобы очистить термоядерный белок, ввините отфильтрованный супернатант из петли образца в пятими миллилитр никель-нитролотриацетический столбец в систему очистки с линейным градиентом от 20 до 250 миллимолейных имидазолов. Клив элайт целевой белок с табаком etch вирус протеазы, на 1-к-50 соотношение, на ночь при 4 градусах по Цельсию, и очистить смесь реакции расщепления на амилозы смолы колонке, и никель-нитролотриацетический столб, чтобы удалить тег и табак etch вирус протеазы.
Диализовать поток через никель-нитролотриацетический столбец против буфера диализа, чтобы уменьшить концентрацию соли, и очистить образец на столбце обмена аниона линейным градиентом от 20 до 500 миллимолярия хлорида калия в буфере элюции. Затем сосредоточьте белок в центробежной концентраторе. Ввимите концентрированный белок в столбец фильтрации геля Superdex 200 26/600, чтобы проверить однородность и оценить чистоту белка на 15%SDS-PAGE.
Чтобы подготовить белок к кристаллизации, сосредоточьте очищенный образец белка до 10 миллиграммов на миллилитр в центробежной концентраторе и буферный обмен на буфер кристаллизации до хранения 80 градусов по Цельсию. Для проведения скрининга кристаллизации используйте метод диффузии паров сидя в 295 Кельвине, с несколькими наборами кристаллизации и автоматизированной системой обработки жидкости в формате 96 колодец. В конце настройки капли запечатать 96-хорошо кристаллизации пластины для предотвращения испарения, а также для обеспечения равновесия белка падение в буфере резервуара.
Поместите пластины в хрустальный инкубатор при 18 градусах по Цельсию. Периодически проверяйте пластины под световым микроскопом, чтобы следить за образованием и ростом кристаллов. Чтобы отличить кристаллы белка от кристаллов соли, добавьте один микролитер протеинового кристаллического красителя в целевую каплю и наблюдайте за кристаллами под микроскопом через час.
Кристаллы белка будут выглядеть синими. Для дальнейшей оптимизации кристаллов используйте положительные условия кристаллизации и метод диффузии пара в 24-хорошо пластин, а затем инкубации в кристалле инкубатора при 18 градусов по Цельсию. Чтобы определить структуру белка, установите кристаллы на криолуп под световым микроскопом для флэш-охлаждения в жидком азоте, и поместите кристаллы в unibuck для хранения и транспортировки.
Предварительный экран кристаллов в доме рентгеновского дифрактора, используя ручную функцию центрирования для установки и центра кристаллов. Затем используйте рентгеновское программное обеспечение для дифракции для сбора данных. Для индексации, интеграции и масштабирования набора данных с помощью набора HKL-2000, во-первых, выберите детектор и загрузите набор данных.
Затем выполнить функцию пикового поиска, чтобы найти дифракционные пятна. Индексировать пятна, выбрать правильную космическую группу и выполнить пик интеграции. Затем масштабировать набор данных.
Снова отрегулируйте модель ошибки и масштаб. Сохранить выход sca файл. Чтобы определить структуру с помощью пакета программного обеспечения Phenix, создайте новый проект.
Во-первых, запустите Extriage с файлом sca, чтобы вычислить возможное количество копий белковых молекул в асимметричном блоке. Далее, чтобы решить проблему фазы путем молекулярной замены, запустите Phaser, используя файл данных дифракции, файл структуры шаблона с высокой последовательностью идентичности и структурное сходство в качестве целевого белка, и файл последовательности белка, чтобы найти решение. Выполните автоматическое построение в Phenix для создания исходной модели, используя выходной файл из Phaser и файл последовательности из целевого белка.
Вручную встроить структуру в модифицированную экспериментальную плотность электронов с помощью COOT и усовершенствовать с помощью Phenix уточнить в итеративных циклов. Проверка окончательной модели с помощью инструментов проверки в Phenix. В этом репрезентативном эксперименте, очистка конечного терминала домена белка рецептора diamondback moth ryanodine, как попродемонстрировано, дала одну полосу около 21 килодальтонов с помощью анализа STS-PAGE.
Объем элюции из столбца фильтрации геля подтвердил, что очищенный рецептор райанодина является мономером. Для кристаллизации наиболее оптимальными условиями, при которых формировались высококачественные кристаллы в форме пластины, было наличие 1 молярного HEPES рН 7 и 1,6 мларного сульфата аммония. Определение структуры белка из набора данных дифракции с использованием программного обеспечения, как показано показали Diamondback моли ryanodine рецептор конечного терминала домена, охватывающих остатки от 1 до 205.
Белки с большим расстройством, гибкие регионы, или со слабым сродством являются сложными для кристаллизации. В этих сценариях стратегии белковой инженерии, такие как уменьшение поверхностной энтропии, утяжение петли и перекрестные связи, могут увеличить вероятность получения лучших кристаллов белка. В дополнение к выявлению структур белка высокого разрешения, рентгеновская кристаллография также может быть использована для изучения белково-пестицидных взаимодействий, которые могли бы помочь в проектировании пестицидов на основе структуры.
