Высоким разрешением сравнение частот бактериальных спряжение

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области микробиологии о том, как часто плазмидная ДНК может распространяться среди различных бактерий. Основным преимуществом этого метода является то, что, уменьшая фон, мы можем обнаружить небольшие различия в частоте спряжения с высоким разрешением. Демонстрацией процедуры будет Косукэ Янагия, аспирант моей лаборатории.

Чтобы вычислить частоту спряжения по наиболее вероятному числу, фильтр мат один миллилитр от ночной донорской культуры с одним миллилитром от ночной культуры получателя в течение 45 минут при 30 градусах по Цельсию, как только что продемонстрировано. В то время как ко-культура инкубации, последовательно разбавить оригинальные доноров и реципиентов культур для покрытия в трижды на донора бульона Лурия, или LB, а также канамицин, или получатель LB плюс гентамицин пластин для двухдневной культуры на 30 градусов по Цельсию. В конце инкубации, повторное производство культуры на фильтре в стерильных LB, содержащих канамицин и гентамицин для последовательного разбавления в 96-хорошо клеточной культуры пластины в четыре раза.

После двух дней при 30 градусах По Цельсию вручную подсчитывайте колониообразующие единицы, или CFUs, на донорских и реципиентных агарных пластинах и количестве скважин, в которых трансъюганты растут с помощью световой микроскопии. Для расчета наиболее вероятного числа и его отклонения откройте программу расчета MPN. Введите имя и дату эксперимента, количество тестовых серий и максимальное количество разбавлений в строке семь программный лист файла электронной таблицы.

В автоматически подготовленных таблицах входных данных введите формулу в столбце фактора разбавления D, 0,01 в объеме в миллилитров или колонке ГВт и четыре в количестве труб N колонки. Введите количество скважин, в которых трансъюганты росли при каждом разбавлении выборки, и нажмите вычислить результаты, чтобы получить результаты как наиболее вероятное число на миллилитр, а также верхние и нижние пределы доверия 95%. Затем разделите количество трансконъюгантов на количество доноров и колоний-реципиентов, образующих единицы на миллилитр для расчета частоты спряжения плазмидов.

В этом репрезентативном эксперименте частота спряжения обеих плазмидов увеличивалась с более высокими скоростями перемешивания с максимальной разницей в частоте спряжения, наблюдаемой между нулем и 400 об/мин для культур, введенных в плазмиду pBP136:gfp, и между нулем и 200 RPM для культур, которые были введены в плазмиду pCAR1:gfp. Для определения плотности клеток-реципиентов, необходимых для сравнения вероятности спряжения, были проведены брачные анализы с различными плотностями доноров и реципиентов. В этом репрезентативном эксперименте, pBP136:gfp трансъюганты были обнаружены в 100% скважин, содержащих один раз от 10 до третьего CFU донора и один раз от 10 до 10 раз от 10 до седьмого CFU реципиента, и те, с одним разом 10 ко второму CFU донора и один раз от 10 до шестого до 10 к седьмому CFU реципиента , что указывает на то, что плотность клеток была слишком высокой.

Однако спаривание анализов с 10 КФУ донора и от 10 до шестого или 10 до пятого КФУ реципиента, однако, привело к снижению числа трансъюгантных положительных скважин. Таким образом, было предсказано, что для спаривания с одной донорской клеткой потребуется от 10 до пятого КФУ реципиента. Брачные анализы с pCAR1:gfp при разной плотности штаммов донора и реципиента продемонстрировали аналогичные выводы, хотя в целом процент трансъюгентных положительных скважин был значительно ниже, чем у pBP136:gfp.

Если предположить, что донорские и реципиентные клетки могут прикрепляться друг к другу аналогичным образом, вероятность спряжения донора pCAR1 была ниже, чем у донора pBP136. На основе этих результатов, было подсчитано, что от 10 до седьмого CFU реципиента требуется для одной донорской клетки отсортированы FACS. После подсчета количества трансъюгантных положительных скважин процент трансъюгантных положительных скважин для pBP136:gfp был определен как больше, чем для pCAR1:gfp, демонстрируя более чем 36-кратную разницу в вероятности инициированного донором спряжения между этими двумя плазмидами.

При попытке процедуры, важно помнить, чтобы всегда разбавлять бактериальные смеси тщательно.