Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da microbiologia sobre a frequência com que o DNA plasmídeo pode ser espalhado entre diferentes bactérias. A principal vantagem dessa técnica é que, reduzindo o fundo, podemos detectar pequenas diferenças na frequência de conjugação com alta resolução. Demonstrando o procedimento será Kosuke Yanagiya, um estudante de pós-graduação do meu laboratório.
Para calcular a frequência de conjugação pelo número mais provável, filtrar um mililitro de uma cultura de doadores durante a noite com um mililitro de uma cultura receptora durante a noite por 45 minutos a 30 graus Celsius, como apenas demonstrado. Enquanto a co-cultura está incubando, dilui seriamente as culturas originais de doadores e receptores para chapeamento em triplicado no caldo de Luria doador, ou LB, mais kanamycin, ou lb receptor mais placas de gentamicina para uma cultura de dois dias a 30 graus Celsius. No final da incubação, resuspenque a cultura no filtro em LB estéril contendo kanamycina e gentamicina para diluição serial em uma placa de cultura celular de 96 poços em quadruplicato.
Após dois dias a 30 graus Celsius, conte manualmente as unidades formadoras de colônias, ou UFC, nas placas de ágar doador e receptor e o número de poços em que os transconjugantes crescem por microscopia leve. Para calcular o número mais provável e seu desvio, abra o programa de cálculo do MPN. Digite o nome e a data do experimento, o número da série de testes e o número máximo de diluições na linha sete da folha de programa do arquivo da planilha.
Nas tabelas de dados de entrada produzidas automaticamente, digite a fórmula na coluna fator D de diluição, 0,01 no volume em mililitros ou coluna GW e quatro no número de tubos n coluna. Insira o número de poços em que os transconjulgadores cresceram a cada diluição amostral e clique em calcular os resultados para obter os resultados como o número mais provável por mililitro, e os limites de confiança superior e inferior de 95%. Em seguida, divida o número de transconjugantes pelo número de unidades formadoras de doadores e colônias receptoras por mililitro para calcular a frequência de conjugação dos plasmídeos.
Neste experimento representativo, a frequência de conjugação de ambos os plasmídeos aumentou em taxas de agitação mais elevadas com uma diferença máxima na frequência de conjugação observada entre zero e 400 RPM para culturas introduzidas ao plásmídeo pBP136:gfp, e entre zero e 200 RPM para culturas que foram introduzidas ao plasmídeo pCAR1:gfp. Para determinar a densidade das células receptoras necessárias para comparar a probabilidade de conjugação, foram realizados ensaios de acasalamento com diferentes densidades de doadores e receptores. Neste experimento representativo, foram detectados transconjugantes pBP136:gfp em 100% dos poços contendo uma vezes 10 para a terceira UFC de doador e uma vez 10 para o quinto a um vezes 10 para a sétima UFC do receptor, e aqueles com uma vezes 10 para a segunda UFC de doador e uma vez 10 para o sexto a 10 para o sétimo UFC do receptor de receptor , indicando que a densidade celular era muito alta.
Ensaios de acasalamento com 10 UFC de doador e 10 para o sexto ou 10 para o quinto UFC do receptor, no entanto, resultou em uma diminuição do número de poços positivos transconjugut. Assim, 10 a 5 UFC foi prevista para o acasalamento com uma única célula doadora. Ensaios de acasalamento com pCAR1:gfp em diferentes densidades de cepas de doadores e receptores demonstraram achados semelhantes, embora no geral os percentuais de poços positivos transconjugut foram muito inferiores aos de pBP136:gfp.
Supondo que as células doadoras e receptoras possam se anexar da mesma forma, a probabilidade de iniciação conjugal para o doador pCAR1 foi menor do que para o doador pBP136. Com base nesses resultados, estima-se que 10 a 7ª UFC foi necessária para uma única célula doadora classificada pela FACS. Após a contagem dos números de poços positivos transconjugut, o percentual de poços positivos transconjugut para pBP136:gfp foi determinado como maior do que o de pCAR1:gfp, demonstrando uma diferença de mais de 36 vezes na probabilidade de o doador iniciar a conjugação entre esses dois plasmídeos.
Ao tentar o procedimento, é importante lembrar de sempre diluir cuidadosamente as misturas bacterianas.
