Судорожная активность, индуцированная электрошоком у личинок дрозофил

В этом протоколе подробно описывается использование личинок дрозофилы для идентификации уникальных противосудорожных соединений для лечения эпилепсии.

Эпилепсия представляет собой значительную нагрузку на здоровье, которая усугубляется большим числом людей, не поддающихся лечению. В то время как некоторые пациенты с лекарственной резистентностью реагируют на немедикаментозное лечение (например, стимуляцию блуждающего нерва, кетогенную диету и т. д.), последним средством для многих является сложная и дорогостоящая хирургия для облегчения судорог. Хотя общепризнано, что требуются противосудорожные препараты с более широким диапазоном мишеней, препятствием на пути к достижению этой цели является идентификация новых мишеней для лекарств. Генетически податливые модельные животные являются многообещающими в этом отношении. Плодовая муха, Drosophila melanogaster, стала мощной моделью для исследования механистической основы судорог и их более эффективного лечения. Многие выявленные мутации мух приводят к тому, что личинки и взрослые особи проявляют судорожную активность в ответ на сильную стимуляцию (электрическую, механическую и/или термическую). Многие из этих мутаций находятся в генах, гомологичных тем, которые способствуют генетической эпилепсии человека (например, потенциал-зависимый канал Na⁺ ). Кроме того, теперь можно заменить ген мухи его человеческим эквивалентом, который также несет мутацию, связанную с заболеванием. Таким образом, скромная муха стала аватаром для моделирования человеческой болезни. В этом исследовании описан подходящий метод использования личинок дрозофилы для скрининга лекарств с низкой и средней пропускной способностью с целью выявления уникальных соединений и их мишеней, обладающих противосудорожным потенциалом.

Эпилепсия остается значительным бременем для здоровья, затрагивая примерно 1% населения мира. Несмотря на то, что в настоящее время существует более 30 противосудорожных препаратов (ПКМ) для клинического лечения, около трети людей с эпилепсией остаются лекарственно-рефрактерными, что означает, что они плохо реагируют на^{медикаментозное лечение.} Имеющиеся препараты также являются только паллиативными и, как таковые, не препятствуют эпилептогенезу и не обеспечивают излечения³. Таким образом, существует острая необходимость в определении более эффективных методов лечения эпилепсии. Препятствием на пути разработки более эффективных методов лечения является идентификация новых мишеней для лекарств. Действительно, почти все современные АСМ воздействуют на аналогичные мишени: ионные каналы, в том числе потенциал-зависимый натриевый канал (Na_v), и тормозную нейротрансмиссию, опосредованную γ-аминомасляной кислотой (ГАМК)^4,5. Общепризнано, что дальнейшее использование традиционных методов разработки лекарств вряд ли радикально изменит этот сценарий.

Лабораторные модельные животные, включая, но не ограничиваясь, плодовую муху Drosophila melanogaster и данио-рерио Danio rerio, полезны для идентификации новых ASM ^6,7,8. Действительно, поиск в PubMed по запросу «дрозофила + судорога» дает 342 результата, в то время как тот же поиск по данио-рерио дает 578 результатов (оба поиска были проведены 29^января 2025 года). Несмотря на то, что количество подобных исследований на мышах (~15 000) незначительно, количество исследований с использованием модельных систем продолжает расти. Эти исследования возможны благодаря механистическому сохранению функции ЦНС во всех типах. Более того, индуцированные судороги у мух и рыб эффективно лечатся с помощью клинически используемых АСМ, показывая, что, хотя нюансы судорожного поведения могут внешне казаться различными, лежащие в их основе механизмы имеют^{много общего.}

Плодовая муха, дрозофила, внесла большой вклад в понимание биологии человека. Что касается эпилепсии, то эта модельная система предоставляет беспрецедентный генетический инструментарий в сочетании с идентифицируемыми и экспериментально доступными^{нейронами.} Кроме того, в настоящее время опубликованы коннектомы как для личинки, так и для взрослой ЦНС, и^{были идентифицированы} многочисленные клеточно-специфические генетические движущие линии. Важно отметить, что по счастливой случайности был идентифицирован класс мутаций, при которых взрослые мухи реагируют на сильную механическую стимуляцию потерей осанки и судорожной активностью (например, жужжанием крыльев, тряской ног и т. д.). Этот класс мутаций был назван «чувствительными к взрыву»13,14,15,16. С тех пор был идентифицирован второй класс судорожной мутации, которая реагирует на повышение температуры, отражая фебрильные судороги человека^17,18. Тем не менее, экспериментальная податливость взрослых мух несколько снижена по сравнению с личиночной стадией этой же модели насекомых. Например, может быть трудно кормить взрослых мух лекарствами, а более инвазивные методы, такие как электрофизиология и оптогенетика, могут быть более сложными. Напротив, личинка дрозофилы постоянно ест, чтобы увеличить объем своего тела в ~100 раз всего за 5 дней, чтобы обеспечить окукливание. Поэтому мы можем быть уверены в адекватном кормлении препаратами на личиночных стадиях. Эмбриогенез хорошо задокументирован и может быть точно спрогнозирован, а он, в свою очередь, определил ключевые вехи в развитии ЦНС, включая первое приобретение электрических свойств нейронов вплоть до формирования цепи¹⁹. После вылупления личинка проходит через 3 линьки (или стадии), пока на 5-й день она не становится «блуждающей», после чего она покидает пищу, чтобы найти безопасное место для окукливания. Через ~100 часов после окукливания появляется взрослая муха с новым телом и ЦНС (Рисунок 1).

Методы индуцирования судорог у взрослых особей не очень хорошо подходят для личиночных стадий. У личинок отсутствуют сенсорные волоски, синхронная активация которых при механической стимуляции может привести к припадку. Таким образом, для преодоления этих трудностей была разработана техника электрошока, позволяющая вызывать судороги на стадии блуждающей личинки. Последующий сравнительный анализ методов индукции судорог как у личинок, так и у взрослых особей показывает, что электрошок личинок гораздо меньше зависит от типа мутации (например, чувствительность к взрыву в зависимости от температуры). Таким образом, мы полагаем, что этот метод должен быть предпочтительным методом для тестирования новых мутаций, где оптимальный метод индукции судорог неизвестен^. Техника электрошока личинками проста, быстра и требует минимального оборудования. Этот метод обеспечивает эффективные средства для скрининга новых соединений или генетической терапии на предмет противосудорожной эффективности в отношении ряда мутаций, которые отражают генетическое разнообразие эпилепсии человека.

В этом исследовании используется плодовая муха, Drosophila melanogaster (подробности см. в разделе «Результаты»). Этот метод лучше всего подходит для блуждающих личинок третьего возраста (L3). Протокол эксперимента относительно прост, но требует практики для совершенствования. По нашему опыту, новым студентам требуется около 2 недель, чтобы освоить анализ, и они получают большую пользу от наблюдения за тем, как другие, более опытные исследователи выполняют анализ в режиме реального времени с использованием микроскопа для препарирования с камерой или аналогичного микроскопа. Реагенты и оборудование, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Выбор личинок

1. Соберите личинок с боковых сторон флаконов/бутылок от мух, содержащих стандартный корм (5 л воды, 390 г глюкозы, 360 г кукурузы, 250 г дрожжей, 40 г агара, 135 мл нипагина, 15 мл пропионовой кислоты).
2. Используйте только личинок, которые активно двигаются и покинули пищу, чтобы ползти вверх по стенкам контейнера (блуждающие третьи возрасты, L3). Не отбирайте предкуколок, у которых наблюдается значительно сниженная локомоция.

2. Процедура электрошока

1. Удалите одну блуждающую L3 и переложите ее в маленькую пластиковую чашку Петри (размер не имеет значения) и аккуратно вымойте ее с помощью ddH₂O, чтобы удалить остатки пищи. Для этого подойдет маленькая (000) кисть.
2. Переложите однократно промытую личинку, с помощью кисти, в пустую пластиковую посуду (опять же, размер значения не имеет). Обсушите личинку небольшим фрагментом бумажного полотенца, проведенным щипцами. Удалите излишки ddH₂O, но не высушивайте личинки полностью, чтобы избежать их прилипания к пластиковой посуде.
3. Дайте личинке восстановиться в течение 30 с. Это облегчит размещение электрошокового щупа (см. ниже).
4. Рассмотрите личинок под маломощным микроскопом для препарирования (15-20x) и, как только нормальное ползание возобновится, осторожно поместите электрошоковый зонд (см. шаг 3 для подробностей и рисунок 2A) на переднюю дорсальную поверхность личинки над приблизительным положением ЦНС (см. рисунок 2C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение, необходимо приложить достаточное давление, чтобы обеспечить хорошую проводимость между проволокой зонда и кутикулой, но будьте осторожны, чтобы не повредить личинки. Таким образом, раздавите личинку примерно на одну треть или половину ее глубины.
5. Подайте импульс постоянного напряжения длительностью 2 с, сила которого была заранее определена с помощью кривой титрования (рис. 3). Здесь подойдет любой изолированный стимулятор напряжения. Тот, который используется здесь, показан на рисунке 2B.
6. После поражения электрическим током запустите таймер. В ответ на шок личинки инициируют преходящий паралич, за которым следуют периодические спазмы мышечной активности стенок тела и перекатывания, останавливающие нормальное ползание.
7. Останавливайте таймер, когда личинка явно отошла от своего первоначального места на блюде. Продолжительность припадка, или время восстановления (ЛТ), определяется как период между возникновением стимула и возобновлением нормального ползающего поведения (например, полной перистальтической волны вперед, которая приводит к движению вперед).
8. В конце каждого дня тщательно очищайте провода зонда, сначала промыв их в 100% этаноле, а затем ddH₂O. Внимательно осмотрите провода под увеличением и, при необходимости, с помощью щипцов аккуратно соскребите остатки с проводов. При этом будьте очень осторожны, чтобы не изменить расстояние между двумя проводами.

3. Конструкция электрошокового щупа

1. Потребуется отрезок электрического провода 2 x 1 м (должен быть тонким и гибким, т.е. рассчитанным на ~3 А). К концу каждого провода припаяйте вольфрамовый провод длиной 5 см (чтобы максимизировать контакт, перед пайкой намотайте вольфрамовый провод на открытый конец электрического провода). Припаяйте быстроразъемные разъемы (например, вилки типа «банан») к другому концу проводов, подходящие для удобного подключения к стимулятору напряжения.
2. Закрепите оба вольфрамовых провода на держателе электрода так, чтобы провода были параллельны друг другу (Рисунок 2). Небольшие участки стеклянных капилляров (~2 см в длину) используются для удержания проводов на месте под стопорным винтом зонда.
3. С помощью щипцов согните провода таким образом, чтобы они подходили на расстояние 1-2 мм к тому месту, где они выходят из держателя провода. Сгибать вольфрамовые провода непросто, потому что провода сохраняют «память» - поэтому требуется настойчивость. Советы, которые помогут в этом процессе, включают использование электрической изоляционной ленты и/или blu-tack (или аналогичной шпаклевки) для поддержания проводов в правильной ориентации/расстоянии.

4. Калибровка щупа

1. Убедитесь в наличии запасов блуждающего L3 подходящего дикого типа (отрицательный контроль) и судорожного мутанта (положительный контроль). Потребуется ~100 штук каждого.
2. Подготавливайте личинок, по одной, как описано выше.
3. С помощью зонда можно подать диапазон напряжений на достаточное количество личинок каждого генотипа для каждого тестируемого напряжения. Рекомендуется применять напряжение 0 В, 2 В, 4 В, 6 В, 8 В, 10 В и 12 В в течение 2 с в диапазоне 10-15 личинок на напряжение. Ударяйте током каждую личинку только один раз.
4. Измерьте время восстановления для каждой личинки и рассчитайте среднее значение для каждого шага напряжения, применяемого для обоих генотипов.
5. Нанесите средние значения на график и подогнайте данные под прямую линию.
6. Выберите напряжение с четкой и существенной разницей между контрольным и судорожным мутантом. Будьте осторожны и не выбирайте напряжение, которое дает слишком долгое время восстановления; В противном случае производительность пострадает из-за длительного ожидания восстановления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании часто использовалось напряжение стимуляции, которое приводит к времени восстановления 50-100 с для дикого типа и 200-300 с для ^{пара-бсс.} Примеры кривых калибровки показаны на рисунке 3. Важно использовать 0 В для учета акта нажатия зонда на спинную поверхность личинки. Это вызовет некоторую степень паралича, который, вероятно, является защитным механизмом личинки.

5. Проведение экспериментов

1. Электрошоковая личинка желаемого генотипа (генотипов) или воздействия лекарственного препарата и измерение времени восстановления после судорог.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для испытуемых личинок обычно достаточно n = 20, но расчет мощности, основанный на экспериментальном анализе, даст более точное число n.
2. Всегда проводите отрицательный (например, дикий тип) и положительный (например, para^bss) контроль во время каждого эксперимента. Число n не обязательно должно быть большим; n = 5 достаточно. Это обеспечит уверенность в том, что анализ сработал должным образом (например, нет проблем с зондом или стимулятором).
3. Применяйте пороговое значение (например, 300 с), чтобы избежать слишком длительного времени восстановления, и рассматривайте количественные судороги только как те, у которых время восстановления превышает 30 с.

6. Скрининг на наркотики

1. Добавляйте препараты, растворенные в соответствующем растворителе, непосредственно на поверхность пищи и дайте впитаться (а при использовании этанола – время для испарения растворителя). Или, в качестве альтернативы, можно добавить лекарство (в соответствующем растворителе) в растопленный корм от мух. Подробности см. в разделе «Результаты».
2. Чтобы добавить препарат к растопленной пище, выньте пищу из флаконов, повторно расплавьте и, когда пища остынет до 40 °C, добавьте препарат, перемешайте с помощью вихревого миксера, а затем снова разложите 5 мл растопленной пищи по флаконам и дайте остыть перед использованием.
3. Запустите градиент концентрации, чтобы определить оптимальную концентрацию препарата.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошей отправной точкой является добавление 3 мМ раствора препарата либо непосредственно на поверхность пищи (200 μл на стандартный флакон дрозофилы ), либо до концентрации 3 мМ в расплавленной пище. Взрослым самкам можно позволить откладывать яйца непосредственно в этот корм или добавлять личинки на выбранных этапах по мере необходимости. Используемый растворитель (растворители) должен быть добавлен отдельно в выбранные флаконы в качестве контроля транспортного средства.

Многочисленные мутации дрозофилы демонстрируют усиленное судорожное поведение ^7,20. Генетическая основа этих мутаций разнообразна, что выгодно имитирует столь же разнообразные генетические причины эпилепсии человека. Три наиболее изученные мутации дрозофилы — это para^{bangsenseless} (para^bss), julius seizure (jus) и easy-shocked (eas). Мутация para^bss приводит к усилению функции паралитического потенциал-зависимого Na⁺ канала, который кодирует этаноламинкиназу, и jus является еще не идентифицированным мембранным белком (обратите внимание, что jus до недавнего времени назывался slamdance)16,21,22. Многие из этих генов имеют человеческие гомологи. Например, паралитик является гомологом человеческих генов_Nav, мутации которых являются основной причиной генетической эпилепсии²³. Как и в случае с эпилепсией человека, эти три «чувствительные» мутации мухи демонстрируют дифференциальную «тяжесть» припадка в ответ на удар электрическим током (рис. 4). Самое длительное время восстановления (т.е. наиболее тяжелое судорожное поведение) демонстрируется para^bss, в то время как jus демонстрирует самое короткое время восстановления. Этот дифференциальный ответ, обусловленный различными основными генетическими мутациями, позволяет экспериментатору проверить, как соединения свинца могут уменьшить судороги при ряде мутаций, чтобы выявить те, которые имеют благоприятную активность широкого спектра.

Многие ASM, используемые в клинике, одинаково эффективны в моделях припадков дрозофилы, что указывает на то, что основные механизмы, вызывающие судороги у дрозофилы, аналогичны тем, которые приводят к припадкам у людей с эпилепсией^. На рисунке 5 показано влияние двух наиболее клинически используемых АСМ, вальпроата натрия (ВПА) и фенитоина (PHY), против ^{пара-БСС}. Личинкам позволяли питаться в неограниченном количестве ASM, содержащимся в пище (добавляемым к расплавленной пище) в концентрации 3 мМ в течение всего их личинового развития. В каждый эксперимент включали дикий тип (Canton-S, CS) и управление транспортным средством с^пара-bss (этанол и воду соответственно), а также para^bss, подаваемый на соответствующий ASM. Наблюдается явное и значительное сокращение времени восстановления после приступов (ЛТ) для обоих препаратов. Учитывая, что как дикий тип, так и известная судорожная мутация (para^bss), без воздействия ASM, проявляют ожидаемую судорожную активность, мы можем быть уверены в достоверности этих двух экспериментов. Когда это не так, анализы следует отбросить, а эксперимент следует повторить. Основной причиной такого «отказа» часто является повреждение электрошокового щупа, низкий заряд батареи стимулятора и/или неопытность экспериментатора. Также следует избегать содержания мух при температуре ниже 25 °C (см. раздел «Обсуждение»). Хотя этот метод не подходит для высокопроизводительного скрининга, недавно он был использован в низкопроизводительном скрининге ~30 соединений для идентификации нового класса химических веществ, которые эффективно уменьшают судороги за счет манипуляций с Pumilio - регулятором нейронального гомеостаза. Положительный перевод этих же соединений для уменьшения судорог в определенных моделях судорог у мышей показывает захватывающий потенциал для дальнейшей разработки как ведущих соединений, так и новой мишени^26,27.

При рассмотрении репрезентативных результатов, показанных здесь (Рисунок 4 и Рисунок 5), становится очевидным, что существует вариативность в разбросе данных. Существует также небольшая разница в значении wildtype между данными, представленными на этих двух рисунках. Вот почему этот анализ является качественным и не подходит для выявления небольших различий в тяжести приступов, как между генотипами, так и в скрининговых анализах на наркотики. Тем не менее, этот анализ хорошо подходит для идентификации фенотипа судорог при неизвестных мутациях и/или для первоначального тестирования соединений на антисудорожную активность²⁷. Однако для дальнейшего совершенствования разработки лекарств потребуются другие анализы.

Рисунок 1: Жизненный цикл дрозофилы . Схема, показывающая жизненный цикл дрозофилы , от эмбриона до взрослой особи, через окукливание. Показанные сроки являются приблизительными для проявления при 25 °C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Конструкция и размещение электрошокового зонда. (A) показывает изображения зонда как сверху, так и сбоку. Blu-tack используется для поддержания расстояния между проводами ~2 мм, поскольку вольфрамовые провода отходят от зонда. Короткие участки стеклянных капилляров (стрелка) удерживают вольфрамовые провода на месте. Электрические провода, которые подключаются к стимулятору, закрыты и удерживаются вдоль рукоятки зонда электрической изолентой. (B) показан рекомендуемый изолированный стимулятор с постоянным напряжением, использованный в этом исследовании. (C) показано приблизительное расположение стимулирующего зонда на передней дорсальной поверхности блуждающей личинки третьего возраста. Обратите внимание, что пробивные провода проходят через тело личинки, а область непосредственно над ЦНС находится на расстоянии ~2 мм между проводами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Кривая калибровки. Перед началом экспериментов необходимо определить подходящее напряжение для поражения электрошоком. Все щупы будут немного отличаться из-за особенностей их изготовления. Дикий тип (в данном случае Canton-S, CS) и судорожный мутант (рекомендуется, para^bss) подвергаются нарастающим ударам напряжения, каждый из которых устанавливается с фиксированной продолжительностью 2 с. Личинки подвергаются удару током только один раз, и для каждого испытываемого напряжения следует использовать минимум n = 10 (в этом случае n = 12). Из подгонки линий видно, что пункт^bss показывает увеличенное время восстановления после судорог при всех напряжениях. Выбранное напряжение должно давать четкую и значимую разницу между контрольными и судорожными мутантами. На показанном графике различия значимы при напряжении 6 В и выше (p ≤ 0,0001, двусторонний ANOVA с множественными сравнениями Шидака, n = 12, для каждого генотипа и напряжения). Таким образом, в качестве оптимального напряжения для данного зонда было выбрано напряжение 6 В, так как оно дает существенную разницу, при этом время восстановления остается коротким, что сокращает время, затрачиваемое на проведение отдельных поражений электрическим током. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Различные мутации дрозофилы демонстрируют различную степень тяжести припадков. С помощью зонда, откалиброванного на рисунке 3, три судорожных мутанта дрозофилы (para^bss, jus и eas), а также дикий тип (CS) были подвергнуты электрошоку (6 В, 2 с). Отдельные личинки были поражены током только один раз. Время восстановления судорог больше у мутантов судорог, чем у дикого типа, и прогрессивно увеличивается от jus до para^bss (p ≤ 0,0001, соответственно, односторонний ANOVA с множественными сравнениями Тьюки). Статистически значимые сравнения из множественных сравнений Тьюки обозначаются как ****p ≤ 0,0001, ***p ≤ 0,001, **p ≤ 0,01, *p ≤ 0,05. Данные представлены в виде среднего ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Судорожные мутанты дрозофилы реагируют на клинически используемые ASM. Воздействие (А) фенитоина (PHY) и (B) вальпроата натрия (VPA) (3 мМ, соответственно) значительно сокращало время восстановления судорог para^bss (p ≤ 0,01, Kruskal-Wallis с множественными сравнениями Данна, и p ≤ 0,0001, односторонним ANOVA с множественными сравнениями Тьюки, соответственно). Только время восстановления выше 30 с считалось поддающимся количественной оценке судорогой, и в этих анализах использовали пороговое значение 300 с. Каждый анализ наркотиков проводился разными экспериментаторами; Таким образом, показанное среднее время восстановления различается (особенно заметно для ^{пара-БСС} без приема препарата). Это подчеркивает тот факт, что данный анализ является качественным, и, таким образом, дикий тип и судорожный мутант должны быть включены в каждый анализ. Это может позволить нормализовать активность препарата между экспериментами, если это необходимо. Статистически значимые сравнения из множественных сравнений Данна и Тьюки обозначаются как ****p ≤ 0,0001, ***p ≤ 0,001, **p ≤ 0,01, *p ≤ 0,05. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Метод электрошока для индуцирования судорог у личинок дрозофилы обеспечивает простой, но эффективный скрининг для идентификации новых противосудорожных соединений или генетических манипуляций. Однако, поскольку это качественный анализ, его основным ограничением является то, что метод не может легко идентифицировать малые размеры эффекта. Тем не менее, средняя пропускная способность, которую он позволяет, поддаваясь скринингу до ~5 соединений в неделю на одного исследователя, обеспечивает очень мощный анализ всего животного. Простота метода также подходит для лабораторных проектов на уровне бакалавриата. Таким образом, 3-4 исследователя могут провести скрининг многих соединений за относительно короткий промежуток времени и с гораздо меньшими затратами, чем при использовании эквивалентного анализа судорог у мышей. Автоматизация анализа еще больше увеличит производительность. Однако в данном исследовании это сделать не удалось. Литийсодержащий агар с двумя электродами, встроенными в агар, был попытался шокировать несколько личинок одновременно, но безуспешно. Другие методы, возможно, основанные на оптогенетике, могут быть более подходящими для автоматизации²⁸.

Однако простота анализа подрывает необходимость стать специалистом. Положение зонда и давление, прилагаемое во время электрошока, являются критически важными этапами. Постоянство обоих видов снижает вариабельность между периодами восстановления для личинок, подвергшихся удару. Другой важный вопрос заключается в том, как распознать конечную точку припадка, что делает этот анализ качественным, потому что он зависит от того, когда отдельный исследователь решает остановить часы. Когда несколько экспериментаторов в одной и той же лаборатории проводят эти эксперименты, стоит потратить время на просмотр одних и тех же личиночных разрядов, чтобы прийти к единому мнению о том, что такое конечная точка припадка. Это значительно снижает межличностную вариативность. Тем не менее, из примерных результатов, показанных в этом отчете, по-прежнему очевидно, что, хотя эффекты постоянны, временные интервалы могут варьироваться у разных экспериментаторов. Важно также отметить, что развитие личинки при температуре ниже 25 °C (например, 18 °C) снижает тяжесть судорог за счет снижения нервной активности в течение эмбрионального критического^{периода.} Таким образом, предполагается, что для эмбрионального/личиночного развития используется минимум 25 °C. Желательно иметь инкубатор рядом с рабочим столом, и при каждом электрошоке удаляется только достаточное количество личинок. Оставшиеся личинки следует хранить при температуре 25 °C до тех пор, пока они не понадобятся. С практикой экспериментаторы могут поражать током до 4 личинок за раз, разделяя удары с интервалом в 10 с. Такой подход значительно ускоряет прогресс, и за один день можно достичь n 40 личинок (или более). Влажность во время этого исследования не измерялась и не контролировалась. Был выбран стандартный цикл «свет-темнота» 12:12, но его можно варьировать по желанию экспериментатора.

Изготовление зонда является самой сложной частью этого метода. Таким образом, после изготовления следует проявлять большую осторожность, чтобы не повредить его. Любое повреждение электрошокового щупа часто влечет за собой ремонт, поэтому щуп необходимо повторно откалибровать, чтобы определить оптимальное напряжение. Напряжение полностью зависит от расстояния между двумя проводами, и поэтому нет двух одинаковых щупов. Рекомендуется проводить повторную калибровку щупа каждый месяц, чтобы убедиться, что оптимальное напряжение не изменилось. Сила электрошока зависит как от приложенного напряжения, так и от продолжительности напряжения. Таким образом, более короткие длительности с более высоким напряжением, вероятно, вызовут тот же отклик, что и более длительные длительные исследования, использующие более слабую стимуляцию напряжения. Однако это пространство не было исследовано. Предпочтение длительности в 2 с (в данном исследовании) легко удовлетворяется без чрезмерного движения личинок, подвергаемых электротоку. Это обеспечивает сравнительно более низкую силу напряжения, что позволяет избежать повреждения личиночной кутикулы. Эффект стимуляции также будет зависеть от силы тока (ампер), которую мы не измеряем. Тем не менее, различные стимуляторы будут производить разную силу тока, и, таким образом, было обнаружено, что при использовании стимулятора Grass S88²⁵ использовалось напряжение 50 В/3 с, в то время как при использовании используемого здесь стимулятора использовалось 6-12 В/2 с, в зависимости от используемого зонда. Фактическое напряжение/продолжительность использования не слишком важны, если они достаточны для того, чтобы вызвать время восстановления, превышающее время контроля дикого типа, и не причиняют вреда личинке. Поскольку простое помещение зонда на личинку (с использованием 0 В в качестве контроля) вызывает некоторую степень замерзания/паралича (что указывает на попытку избежать хищничества), не существует критериев стимуляции, которые не вызвали бы какое-либо «судорожное» поведение.

Электрошоковый анализ подходит для скрининга препаратов на противосудорожную активность. Проблема всегда платежеспособна. Было установлено, что этанол или ацетон являются лучшими растворителями, чем ДМСО. В текущих экспериментах ДМСО допускается до ~1%, за пределами которого наблюдалась неприемлемая летальность у развивающихся личинок. Из двух вариантов воздействия лекарств на личинок, либо добавление препарата (растворенного в подходящем растворителе) в верхнюю часть флакона с пищей, либо добавление в растопленный корм для мух, было обнаружено, что последний дает лучшие результаты с точки зрения сниженной изменчивости. Однако разница незначительна, и первый способ быстрее. Экспериментаторам рекомендуется сравнить оба метода и выбрать тот, который подходит лучше всего. Мухам можно позволять откладывать яйца на пищу, содержащую наркотики, так что все личиночное развитие подвергается выкапыванию. В качестве альтернативы личинки могут быть помещены на корм, содержащий лекарство, на любой желаемой стадии для определения критического времени активности препарата. Кормление беременных самок лекарственными препаратами является эффективным методом воздействия лекарственных препаратов^на развивающиеся эмбрионы.

Альтернативным и широко используемым анализом судорог является использование эмбрионов рыбок данио, подвергшихся воздействию проконвульсанта пентилентретразола, для скрининга ASM³⁰. На наш взгляд, анализ на личинок дрозофилы имеет много преимуществ. К ним относятся: (1) многие соединения трудно растворить в искусственной морской воде, в которой плавают рыбы; (2) анализ на рыбок данио основан на уменьшении длины плавания, что может произойти либо из-за воздействия ASM, либо, как это ни парадоксально, проконвульсного соединения. Это связано с тем, что повышенная судорожная активность у рыбок данио также приводит к^{снижению плавания}. Таким образом, любые попадания в соединения должны сопровождаться вторичным скринингом, который часто требует измерения рано индуцируемых нейронных генов, таких как c-fos; (3) Рыба может быть использована без лицензии на животное только до 5-го дня после вылупления. Конечно, рыбки данио имеют явное преимущество перед насекомыми в том, что их основным возбуждающим нейромедиатором является глутамат, а не ацетилхолин³¹. Комбинация двух анализов, начиная с дрозофилы и заканчивая рыбками данио, может обеспечить очень мощный скрининг, прежде чем на мышах будет протестировано меньшее количество пораженных соединений.

Подводя итог, можно сказать, что электрошоковый анализ личинок дрозофилы в сочетании с высокой консервативностью генетики и физиологии, общей для мух и млекопитающих, обеспечивает очень эффективный, быстрый и недорогой скрининг для выявления новых противосудорожных методов лечения. Более широкое использование этого насекомого для скрининга лекарств также решит насущную потребность в сокращении количества животных более высокого порядка, используемых для медицинских исследований.

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Мы благодарим многих сотрудников лаборатории Бейнса, которые совместно разрабатывали эту технологию на протяжении многих лет, и, в частности, Ричарда Марли, который приложил немало усилий, чтобы сделать эту технологию прочной и надежной. Благодарим Анну Манро за рисунок личинок, который показан на рисунке 2. Работа в лаборатории Бейнса, которая внесла свой вклад в разработку этого метода, была щедро поддержана BBSRC, MRC и Wellcome Trust. В настоящее время эта работа финансируется за счет гранта исследователя Wellcome Trust для R.A.B. (грант 217099/Z/19/Z). Развитию этой технологии также способствовал Манчестерский центр полетов, который был создан на средства университета и Wellcome Trust (грант 087742/Z/08/Z).