Activité convulsive induite par les électrochocs chez les larves de drosophile

Ce protocole détaille l’utilisation des larves de drosophile pour identifier des composés anticonvulsivants uniques pour le traitement de l’épilepsie.

L’épilepsie représente un lourd fardeau pour la santé, exacerbé par le grand nombre de personnes réfractaires aux médicaments. Bien que certains patients réfractaires aux médicaments répondent à des traitements non médicamenteux (par exemple, la stimulation du nerf vagal, le régime cétogène, etc.), le dernier recours pour beaucoup est une intervention chirurgicale difficile et coûteuse pour soulager les crises. Bien qu’il soit généralement reconnu que des médicaments anticonvulsivants avec un plus large éventail de cibles sont nécessaires, l’obstacle pour y parvenir est l’identification de nouvelles cibles médicamenteuses. Les animaux modèles génétiquement traitables sont prometteurs à cet égard. La mouche des fruits, Drosophila melanogaster, est devenue un modèle puissant pour étudier les bases mécanistes des crises et de meilleurs traitements. De nombreuses mutations de mouches identifiées font en sorte que les larves et les adultes présentent une activité semblable à celle d’une crise en réponse à une forte stimulation (électrique, mécanique et/ou thermique). Bon nombre de ces mutations se trouvent dans des gènes homologues à ceux qui contribuent aux épilepsies génétiques humaines (par exemple, le canal Na⁺ voltage-dépendant). Il est également maintenant possible de remplacer un gène de mouche par son équivalent humain qui, en outre, porte une mutation liée à la maladie. Ainsi, l’humble mouche est devenue un avatar pour modéliser la maladie humaine. Cette étude décrit une méthode appropriée pour utiliser les larves de drosophile pour les criblages de médicaments à faible et moyen débit afin d’identifier des composés uniques, et leurs cibles, qui ont un potentiel anticonvulsif.

L’épilepsie reste un fardeau important pour la santé, touchant environ 1 % de la population mondiale. Même s’il existe aujourd’hui plus de 30 médicaments anticonvulsivants (ASM) pour le traitement clinique, environ un tiers des personnes atteintes d’épilepsie restent réfractaires aux médicaments, ce qui signifie qu’elles ne répondent pas bien au traitement médicamenteux ^1,2. Les médicaments disponibles ne sont également que palliatifs et, en tant que tels, ne préviennent pas l’épileptogénèse et ne^guérissent pas3. Il est donc essentiel d’identifier de meilleurs traitements contre l’épilepsie. L’un des obstacles au développement de traitements plus efficaces est l’identification de nouvelles cibles médicamenteuses. En effet, presque tous les ASM actuels affectent des cibles similaires : les canaux ioniques, y compris le canal sodique voltage-dépendant (Na_v), et la neurotransmission inhibitrice médiée par l’acide γ-aminobutyrique (GABA)^4,5. Il est généralement admis que l’utilisation continue des méthodes traditionnelles de développement de médicaments est peu susceptible de changer radicalement ce scénario.

Les animaux modèles de laboratoire, y compris, mais sans s’y limiter, la mouche des fruits Drosophila melanogaster et le poisson-zèbre Danio rerio, ont une utilité pour l’identification de nouveaux ASM ^6,7,8. En effet, une recherche PubMed pour « Drosophile + crise » renvoie 342 résultats, tandis que la même recherche pour le poisson-zèbre renvoie 578 résultats (les deux recherches ont été effectuées le 29^janvier 2025). Bien qu’éclipsé par le nombre d’études similaires chez la souris (~15 000), le nombre d’études utilisant des systèmes modèles continue de croître. Ces études sont possibles grâce à la conservation mécaniste de la fonction du SNC dans les embranchements. De plus, les crises induites chez les mouches et les poissons sont traitées efficacement avec des ASM utilisés cliniquement, montrant que si les nuances du comportement des crises peuvent sembler extérieurement différentes, les mécanismes sous-jacents ont beaucoup en commun ^7,9,10.

La mouche des fruits, la drosophile, a apporté de nombreuses contributions fondamentales à la compréhension de la biologie humaine. En ce qui concerne l’épilepsie, ce système modèle fournit une boîte à outils génétique inégalée combinée à des neurones identifiables et accessibles expérimentalement⁷. De plus, les connectomes du SNC larvaire et adulte ont maintenant été publiés, et de nombreuses lignées génétiques spécifiques aux cellules ont été identifiées^11,12. De manière significative, une classe de mutation a été identifiée par hasard selon laquelle les mouches adultes réagissent à une forte stimulation mécanique par une perte de posture et une activité semblable à une crise (par exemple, bourdonnement d’ailes, tremblement des pattes, etc.). Cette classe de mutation a été qualifiée de « sensible aux bangs »13,14,15,16. Une deuxième classe de mutation convulsive a depuis été identifiée qui réagit à l’augmentation de la température, reflétant les convulsions fébriles humaines^17,18. Cependant, la tractabilité expérimentale des mouches adultes est quelque peu réduite par rapport au stade larvaire de ce même modèle d’insecte. Par exemple, il peut être difficile de nourrir des mouches adultes avec des médicaments, et des techniques plus invasives telles que l’électrophysiologie et l’optogénétique peuvent être plus difficiles. En revanche, la larve de drosophile mange constamment pour augmenter son volume corporel de ~100 fois en seulement 5 jours pour permettre la nymphose. Par conséquent, nous pouvons être sûrs d’une alimentation adéquate aux stades larvaires. L’embryogenèse est bien documentée et peut être stadifiée avec précision, et elle a, à son tour, identifié des étapes clés dans le développement du SNC, y compris la première acquisition de propriétés électriques neuronales jusqu’à la formation de circuits¹⁹. Une fois éclose, une larve subit 3 mues (ou stades) jusqu’à ce que, le 5e jour, elle devienne « errante », après quoi elle quitte la nourriture pour trouver un endroit sûr pour se nymphoser. Après ~100 h de nymphose, une mouche adulte émerge avec un nouveau corps et un nouveau SNC (Figure 1).

Les techniques visant à induire des crises chez les adultes ne sont pas bien adaptées aux stades larvaires. Les larves n’ont pas de poils sensoriels, dont l’activation synchronisée lors de la stimulation mécanique peut entraîner une crise. Ainsi, pour pallier ces difficultés, une technique d’électrochocs a été mise au point pour induire des convulsions au stade larvaire errant. L’analyse comparative subséquente des techniques d’induction des crises chez les larves et les adultes révèle que l’électrochoc larvaire dépend beaucoup moins du type de mutation (p. ex., sensible à la frange par rapport à la température). Ainsi, nous suggérons que cette technique devrait être la méthode préférée pour tester de nouvelles mutations lorsque la méthode optimale d’induction des crises est inconnue²⁰. La technique de l’électrochoc larvaire est simple, rapide et nécessite un équipement minimal. Cette technique fournit un moyen efficace de cribler de nouveaux composés, ou thérapies génétiques, pour l’efficacité anticonvulsive à travers une gamme de mutations qui reflètent la diversité génétique de l’épilepsie humaine.

La mouche des fruits, Drosophila melanogaster, est utilisée dans cette étude (voir la section Résultats pour plus de détails). Cette technique est la mieux adaptée aux larves errantes du troisième stade (L3). Le protocole expérimental est relativement simple mais nécessite de la pratique pour être perfectionné. D’après notre expérience, les nouveaux étudiants ont besoin d’environ 2 semaines pour maîtriser le test et bénéficient grandement de voir d’autres chercheurs plus expérimentés effectuer le test en temps réel à l’aide d’un microscope de dissection équipé d’une caméra ou similaire. Les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Sélection larvaire

1. Prélever les larves sur les parois des flacons/bouteilles contenant de la nourriture standard (5 L d’eau, 390 g de glucose, 360 g de maïs, 250 g de levure, 40 g de gélose, 135 mL de nipagin, 15 mL d’acide propionique).
2. N’utilisez que des larves qui se déplacent activement et qui ont quitté la nourriture pour ramper sur les côtés du récipient (troisième stade errant, L3). Ne choisissez pas de pré-nymphes, qui présentent une locomotion considérablement réduite.

2. Procédure d’électrochocs

1. Retirez une seule L3 errante et transférez-la dans une petite boîte de Pétri en plastique (la taille n’a pas d’importance), puis lavez-la délicatement avec du ddH₂O pour éliminer les résidus alimentaires. Un petit pinceau (000) convient pour cela.
2. Transférez la larve lavée une seule fois, à l’aide d’un pinceau, dans un plat en plastique vide (encore une fois, la taille n’a pas d’importance). Séchez la larve avec un petit fragment d’essuie-tout tenu à l’aide d’une pince. Retirez l’excès de ddH₂O, mais ne séchez pas complètement les larves pour éviter qu’elles ne collent au plat en plastique.
3. Laissez la larve se rétablir pendant 30 s. Cela facilitera le placement de la sonde d’électrochocs (voir ci-dessous).
4. Observez les larves à l’aide d’un microscope à dissection de faible puissance (15-20x) et, une fois que le comportement normal de rampement reprend, placez doucement la sonde à électrochocs (voir l’étape 3 pour plus de détails et la figure 2A) sur la surface dorsale antérieure de la larve au-dessus de la position approximative du SNC (voir figure 2C).
   REMARQUE : Cette étape est critique, une pression suffisante doit être appliquée pour assurer une bonne conductivité entre le fil de la sonde et la cuticule mais veillez à ne pas endommager les larves. Ainsi, écrasez la larve d’environ un tiers à la moitié de sa profondeur.
5. Appliquez une impulsion de 2 s de tension constante, dont l’intensité a été prédéterminée via une courbe de titrage (Figure 3). Tout stimulateur de tension isolé convient ici. Celui utilisé ici est illustré à la figure 2B.
6. Après le choc électrique, démarrez une minuterie. En réponse au choc, les larves déclenchent une paralysie transitoire suivie de spasmes occasionnels de l’activité musculaire de la paroi corporelle et du comportement de roulement, arrêtant le comportement normal de rampement.
7. Arrêtez la minuterie lorsque la larve s’est clairement éloignée de son emplacement d’origine sur la parabole. La durée des crises, ou temps de récupération (RT), est définie comme la période entre le début du stimulus et la reprise d’un comportement normal de rampement (par exemple, une onde péristaltique complète vers l’avant qui entraîne un mouvement vers l’avant).
8. À la fin de chaque journée, nettoyez soigneusement les fils de la sonde en les rinçant d’abord à 100 % d’éthanol, puis en les rincant à la jdH₂O. Inspectez soigneusement les fils sous grossissement et, si nécessaire, utilisez une pince pour gratter doucement tout résidu des fils. Faites très attention à ne pas modifier la distance entre les deux fils ce faisant.

3. Construction de la sonde d’électrochocs

1. 2 longueurs de fil électrique de 1 m (doivent être minces et flexibles, c’est-à-dire d’une puissance nominale de ~3 A) seront nécessaires. À l’extrémité de chaque fil, soudez une longueur de 5 cm de fil de tungstène (pour maximiser le contact, enroulez le fil de tungstène autour d’une extrémité exposée du fil électrique avant de souder). Soudez les connecteurs à emboîtement (par exemple, les fiches bananes) à l’autre extrémité des fils, ce qui permet une connexion facile au stimulateur de tension.
2. Fixez les deux fils de tungstène à un porte-électrode de sorte qu’ils soient parallèles l’un à l’autre (Figure 2). De petites sections de capillaires en verre (~2 cm de longueur) sont utilisées pour maintenir les fils en place sous la vis de blocage de la sonde.
3. Utilisez une pince pour plier les fils de manière à ce qu’ils arrivent à moins de 1 à 2 mm de l’endroit où ils sortent du support de fil. Plier des fils de tungstène n’est pas facile car les fils conservent une « mémoire » - il faut donc de la persévérance. Les conseils pour faciliter ce processus incluent l’utilisation de ruban isolant électrique et/ou de blu-tack (ou de mastic de modelage similaire) pour aider à maintenir les fils dans l’orientation/distance correcte.

4. Étalonnage de la sonde

1. S’assurer qu’il existe des stocks de L3 errants d’un type sauvage approprié (contrôle négatif) et d’un mutant convulsif (contrôle positif). ~100 de chaque sera nécessaire.
2. Préparez les larves, une à la fois, comme décrit ci-dessus.
3. Utilisez la sonde pour appliquer une gamme de tensions à un nombre suffisant de larves de chaque génotype pour chaque tension testée. Il est suggéré d’appliquer 0 V, 2 V, 4 V, 6 V, 8 V, 10 V et 12 V pendant 2 s entre 10 et 15 larves par tension. Ne choquez chaque larve qu’une seule fois.
4. Mesurez le temps de récupération de chaque larve et calculez la moyenne pour chaque pas de tension appliqué pour les deux génotypes.
5. Tracez les moyennes sur un graphique et ajustez les données avec une ligne droite.
6. Sélectionnez une tension avec une différence claire et significative entre le mutant de contrôle et le mutant de convulsions. Attention à ne pas choisir une tension qui produit un temps de récupération trop long ; Sinon, la productivité en souffrira en raison du long temps d’attente pour la reprise.
   REMARQUE : Cette étude a souvent utilisé une tension de stimulation qui donne un temps de récupération de 50 à 100 s pour le type sauvage et de 200 à 300 s pour ^{le para bss}. Des exemples de courbes d’étalonnage sont illustrés à la figure 3. Il est important d’utiliser 0 V pour tenir compte de l’action de presser la sonde sur la surface dorsale d’une larve. Cela provoquera un certain degré de paralysie, qui est probablement un mécanisme de défense de la larve.

5. Réalisation des expériences

1. Larve d’électrochocs du ou des génotypes souhaités ou exposition au médicament et mesurer le temps de récupération des crises.
   REMARQUE : Pour les larves d’essai, un n = 20 est généralement suffisant, mais un calcul de puissance basé sur une analyse pilote fournira un nombre n plus définitif.
2. Exécutez toujours un contrôle négatif (par exemple, de type sauvage) et un contrôle positif (par exemple, para^bss) au cours de chaque expérience. Les nombres n n’ont pas besoin d’être élevés ; n = 5 est suffisant. Cela vous donnera l’assurance que le test a fonctionné comme prévu (par exemple, aucun problème avec la sonde ou le stimulateur).
3. Appliquez une limite (par exemple, 300 s) pour éviter des temps de récupération trop longs et ne considérez que les crises quantifiables comme celles dont le temps de récupération est supérieur à 30 s.

6. Dépistage des drogues

1. Ajoutez les médicaments, dissous dans un solvant approprié, directement à la surface des aliments et laissez pénétrer (et si vous utilisez de l’éthanol, le temps d’évaporation du solvant). Ou, alternativement, on peut ajouter un médicament (dans un solvant approprié) à la nourriture pour mouches fondue. Voir la section Résultats pour plus de détails.
2. Pour ajouter le médicament à l’aliment fondu, prélevez l’aliment des flacons, faites-le fondre de nouveau et, à mesure que l’aliment refroidit à 40 °C, ajoutez le médicament, mélangez à l’aide d’un mélangeur vortex, puis versez 5 ml d’aliment fondu dans les flacons et laissez refroidir avant utilisation.
3. Exécutez un gradient de concentration pour identifier la concentration optimale du médicament.
   REMARQUE : Un bon point de départ est d’ajouter une solution médicamenteuse de 3 mM soit directement à la surface de l’aliment (200 μL par flacon standard de drosophile ), soit d’obtenir une concentration de 3 mM dans les aliments fondus. Les femelles adultes peuvent être autorisées à pondre des œufs directement dans cette nourriture, ou des larves peuvent être ajoutées à certains stades au besoin. Le ou les solvants utilisés doivent être ajoutés seuls aux flacons sélectionnés comme commandes du véhicule.

De nombreuses mutations de la drosophile présentent un comportement accru semblable à celui d’une crise ^7,20. La base génétique de ces mutations est variée, ce qui imite favorablement les causes génétiques tout aussi variées de l’épilepsie humaine. Trois des mutations de la drosophile les plus étudiées sont para^{bangsenseless} (para^bss), julius seizure (jus) et facilement choqué (eas). La mutation para^bss entraîne un gain de fonction du canal Na⁺ voltage-dépendant paralytique, eas code pour l’éthanolamine kinase, et jus est une protéine membranaire encore non identifiée (notez que jus était appelé slamdance jusqu’à récemment)16,21,22^. Beaucoup de ces gènes ont des homologues humains. Par exemple, le paralytique est un homologue des gènes Na_v humains, dont les mutations sont l’une des principales causes de l’épilepsie génétique²³. Comme pour l’épilepsie humaine, ces trois mutations de la mouche « sensibles aux bangs » montrent une « gravité » différentielle des crises en réponse à un choc électrique (Figure 4). Le temps de récupération le plus long (c’est-à-dire le comportement de convulsion le plus grave) est présenté par le para^bss, tandis que le jus présente le temps de récupération le plus court. Cette réponse différentielle, due à différentes mutations génétiques sous-jacentes, permet à un expérimentateur de tester comment les composés principaux pourraient réduire les crises à travers une gamme de mutations afin d’identifier celles ayant une activité à large spectre favorable.

De nombreux ASM utilisés en clinique sont tout aussi efficaces dans les modèles de crises de drosophile, indiquant ainsi que les mécanismes sous-jacents produisant des crises chez la drosophile sont similaires à ceux qui entraînent des crises chez les personnes atteintes d’épilepsie ^9,24,25. La figure 5 montre l’effet de deux des ASM les plus utilisés cliniquement, le valproate de sodium (VPA) et la phénytoïne (PHY), contre ^{le para bss}. Les larves ont été laissées se nourrir à volonté de l’ASM contenue dans la nourriture (ajoutée à la nourriture fondue) à 3 mM pendant tout le développement larvaire. Des véhicules de type sauvage (Canton-S, CS) et de type para^bss (respectivement à l’éthanol et à l’eau) ont été inclus dans chaque expérience, ainsi que des véhicules nourris au para^bss dans l’ASM respectif. Il y a une réduction claire et significative du temps de récupération des crises (RT) pour les deux médicaments. Étant donné que le type sauvage et une mutation convulsive connue (para^bss), sans exposition à l’ASM, présentent une activité convulsive attendue, nous pouvons être sûrs de la validité de ces deux expériences. Lorsque ce n’est pas le cas, les tests doivent être rejetés et l’expérience doit être répétée. La cause sous-jacente d’une telle « défaillance » est souvent l’endommagement de la sonde d’électrochocs, la faible puissance de la batterie du stimulateur et/ou l’inexpérience de l’expérimentateur. L’entretien des mouches à des températures inférieures à 25 °C doit également être évité (voir section Discussion). Bien que cette technique ne soit pas adaptée au criblage à haut débit, elle a récemment été utilisée dans un criblage à faible débit de ~30 composés pour identifier une nouvelle classe de produits chimiques qui réduit efficacement les crises grâce à la manipulation de Pumilio - un régulateur de l’homéostasie neuronale. Une traduction positive de ces mêmes composés pour réduire les crises dans des modèles de saisie de souris définis montre un potentiel passionnant pour le développement ultérieur des composés principaux et de la nouvelle cible^26,27.

L’examen des résultats représentatifs présentés ici (figures 4 et 5) montre qu’il existe une variabilité dans la répartition des données. Il existe également une différence modeste dans la valeur du type sauvage entre les données présentées dans ces deux figures. C’est pourquoi ce test est qualitatif et ne convient pas pour identifier de petites différences dans la gravité des crises, que ce soit entre les génotypes ou dans les tests de dépistage de médicaments. Cependant, l’essai est bien adapté à l’identification d’un phénotype épileptique dans des mutations inconnues et/ou à l’essai initial de composés pour l’activité anticonvulsivante²⁷. D’autres améliorations du développement de médicaments nécessiteraient toutefois des tests différents.

Figure 1 : Cycle de vie de la drosophile. Un schéma montrant le cycle de vie de la drosophile, de l’embryon à l’adulte, en passant par la nymphose. Les durées indiquées sont approximatives pour un développement à 25 °C. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Conception et emplacement de la sonde d’électrochocs. (A) montre des images d’une sonde à la fois du haut et du côté. Le Blu-tack a été utilisé pour maintenir une distance entre les fils de ~2 mm lorsque les fils de tungstène s’étendent à partir de la sonde. De courtes sections de capillaires en verre (flèche) maintiennent les fils de tungstène en place. Les fils électriques qui se connectent au stimulateur sont recouverts et maintenus le long de la poignée de la sonde par un ruban isolant électrique. (B) montre un stimulateur isolé à tension constante recommandé utilisé dans cette étude. (C) montre le positionnement approximatif de la sonde de stimulation sur la surface dorsale antérieure d’une larve errante du troisième stade. Notez que les fils de la sonde s’étendent à travers le corps larvaire, et que la région immédiatement au-dessus du SNC est à une distance inter-fils de ~2 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Courbe d’étalonnage. Avant les expériences, une tension appropriée doit être déterminée pour les électrochocs. Toutes les sondes seront légèrement différentes en raison de la nature de leur fabrication. Un type sauvage (dans ce cas, Canton-S, CS) et un mutant convulsif (recommandé, para^bss) sont soumis à des chocs de tension croissants, chacun réglé à une durée fixe de 2 s. Les larves ne sont choquées qu’une seule fois, et un minimum de n = 10 doit être utilisé pour chaque tension testée (dans ce cas, n = 12). Il est évident, d’après les ajustements de ligne, que ^{les para bss} montrent un temps de récupération de crise accru à toutes les tensions. La tension choisie doit produire une différence claire et significative entre les témoins et les mutants convulsifs. Dans le graphique présenté, les différences sont significatives à 6 V et plus (p ≤ 0,0001, ANOVA à deux facteurs avec les comparaisons multiples de Šidák, n = 12, par génotype et par tension). Ainsi, 6 V a été choisi comme tension optimale pour cette sonde, car il produisait une différence significative, mais le temps de récupération est court, ce qui réduit le temps nécessaire pour conduire les chocs électriques individuels. Les données sont présentées sous forme de ± moyenne SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Les différentes mutations de la drosophile présentent des niveaux variables de gravité des crises. À l’aide de la sonde calibrée sur la figure 3, trois mutants épileptiques de la drosophile (para^bss, jus et eas), ainsi qu’un type sauvage (CS), ont été soumis à des électrochocs (6 V, 2 s). Les larves individuelles n’ont été choquées qu’une seule fois. Les temps de récupération des crises sont plus longs pour les mutants convulsifs que pour les types sauvages et augmentent progressivement de jus à para^bss (p ≤ 0,0001, respectivement, ANOVA à un facteur avec les comparaisons multiples de Tukey). Les comparaisons statistiquement significatives des comparaisons multiples de Tukey sont indiquées comme suit : ****p ≤ 0,0001, ***p ≤ 0,001, **p ≤ 0,01, *p ≤ 0,05. Les données sont présentées sous forme de ± moyenne SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Les mutants convulsifs de drosophile réagissent aux ASM utilisés cliniquement. L’exposition à (A) la phénytoïne (PHY) et au (B) valproate de sodium (VPA) (3 mM, respectivement) a considérablement réduit le temps de récupération des crises de para^bss (p ≤ 0,01, Kruskal-Wallis avec les comparaisons multiples de Dunn, et p ≤ 0,0001, ANOVA à un facteur avec les comparaisons multiples de Tukey, respectivement). Seuls les temps de récupération supérieurs à 30 s ont été considérés comme une crise quantifiable, et un seuil de 300 s a été utilisé dans ces essais. Chaque test de drogue a été effectué par un expérimentateur différent ; Ainsi, les temps moyens de récupération indiqués diffèrent (particulièrement évidents pour ^{Para BSS} sans médicament). Cela souligne le fait que ce test est qualitatif et que, par conséquent, un type sauvage et un mutant convulsif doivent être inclus dans chaque test. Cela peut permettre de normaliser l’activité du médicament entre les expériences si nécessaire. Les comparaisons statistiquement significatives des comparaisons multiples de Dunn et de Tukey sont indiquées comme suit : ****p ≤ 0,0001, ***p ≤ 0,001, **p ≤ 0,01, *p ≤ 0,05. Les données sont présentées sous forme de ± moyenne SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La méthode par électrochocs pour induire des crises chez les larves de drosophile fournit un dépistage simple, mais efficace, pour identifier de nouveaux composés anticonvulsivants ou des manipulations génétiques. Cependant, comme il s’agit d’un essai qualitatif, sa principale limite est que la méthode ne peut pas identifier facilement les petites tailles d’effet. Néanmoins, le débit moyen qu’il permet, se prêtant au criblage de jusqu’à ~5 composés par semaine, par investigateur, fournit un test très puissant sur l’ensemble de l’animal. La simplicité de la technique convient également aux projets de laboratoire de premier cycle. Ainsi, 3 à 4 chercheurs peuvent cribler de nombreux composés dans un laps de temps relativement court et pour beaucoup moins de dépenses qu’en utilisant un test de saisie équivalent chez la souris. L’automatisation du test augmenterait encore le débit. Cependant, cette étude n’a pas réussi à le faire. Une gélose contenant du lithium avec deux électrodes intégrées dans la gélose a été tentée pour électrocuter plusieurs larves simultanément, mais sans succès. D’autres méthodes, peut-être basées sur l’optogénétique, pourraient être plus adaptées à l’automatisation²⁸.

La simplicité du test, cependant, sape l’exigence de maîtrise. Le positionnement de la sonde et la pression appliquée lors de l’électrochoc sont des étapes critiques. L’uniformité dans les deux cas réduit la variabilité entre les temps de récupération pour les larves choquées. L’autre problème principal est de savoir comment reconnaître le point final de la crise, ce qui rend ce test qualitatif car il dépend du moment où un enquêteur individuel choisit d’arrêter le chronomètre. Lorsque plusieurs expérimentateurs d’un même laboratoire mènent ces expériences, il vaut la peine de passer du temps à observer les mêmes chocs larvaires pour se mettre d’accord sur ce qu’est un point final de crise. Cela réduit considérablement la variabilité entre les personnes. Cependant, il est toujours évident, d’après les résultats exemplaires présentés dans ce rapport, que, bien que les effets soient constants, les délais peuvent varier d’un expérimentateur à l’autre. Il est également important de noter que le développement larvaire à des températures inférieures à 25 °C (p. ex. 18 °C) réduit la gravité des crises en raison d’une diminution de l’activité neuronale au cours d’une période critique embryonnaire²⁹. Ainsi, il est suggéré d’utiliser un minimum de 25 °C pour le développement embryonnaire/larvaire. Il est souhaitable d’avoir un incubateur près de l’établi, et seules les larves suffisantes sont éliminées au besoin pour chaque électrochoc. Les larves restantes doivent être maintenues à 25 °C jusqu’à ce qu’elles soient nécessaires. Avec de la pratique, les expérimentateurs peuvent choquer jusqu’à 4 larves à la fois, en espaçant les chocs par intervalles de 10 s. Cette approche accélère considérablement les progrès, et un n de 40 larves (ou plus) peut être atteint en une journée. L’humidité n’a pas été mesurée ou contrôlée au cours de cette étude. Un cycle standard lumière-obscurité 12:12 a été sélectionné, mais il peut être modifié à la demande de l’expérimentateur.

La fabrication d’une sonde est la partie la plus difficile de cette méthode. Ainsi, une fois réalisé, il faut faire très attention à ne pas l’endommager. Tout dommage causé à la sonde d’électrochocs entraînera souvent une réparation, et la sonde doit donc être recalibrée pour déterminer la tension optimale. La tension dépend entièrement de la distance entre les deux fils et, en tant que telle, il n’est pas probable que deux sondes soient identiques. Il est conseillé de recalibrer une sonde tous les mois pour s’assurer que la tension optimale n’a pas changé. L’intensité de l’électrochoc dépend à la fois de la tension appliquée et de la durée de la tension. Ainsi, des durées plus courtes avec des tensions plus élevées produiront probablement la même réponse que des durées plus longues, en utilisant une stimulation de tension plus faible. Cependant, cet espace n’a pas été étudié. La préférence pour une durée de 2 s (dans cette étude) est facilement accommodée sans que les mouvements excessifs des larves ne soient choqués. Cela permet une tension relativement plus faible, ce qui évite d’endommager la cuticule larvaire. L’effet de la stimulation dépendra également de l’intensité du courant (ampères), que nous ne mesurons pas. Cependant, différents stimulateurs produiront des ampérages différents, et ainsi, il a été constaté qu’en utilisant un stimulateur Grass S88²⁵, une tension de 50 V / 3 s a été utilisée, tandis qu’en utilisant le stimulateur utilisé ici, 6-12 V / 2 s a été utilisé, selon la sonde utilisée. La tension/durée réelle utilisée n’est pas trop importante tant qu’elle est suffisante pour induire un temps de récupération plus long qu’un témoin de type sauvage et n’inflige pas de dommages à la larve. Parce que le simple fait de placer une sonde sur une larve (en utilisant 0 V comme contrôle) provoque un certain degré de congélation/paralysie (indiquant une tentative d’éviter la prédation), il n’y a pas de critères de stimulation qui n’induiront pas un comportement « semblable à une crise ».

Le test par électrochocs est adapté au dépistage de l’activité anticonvulsivante des médicaments. Un problème est toujours la solvabilité. Il a été constaté que l’éthanol ou l’acétone sont de meilleurs solvants que le DMSO. Dans les expériences actuelles, le DMSO est toléré jusqu’à ~1 %, au-delà duquel une létalité inacceptable a été observée chez les larves en développement. Parmi les deux options d’exposition des larves à des médicaments, soit l’ajout de médicament (dissous dans un solvant approprié) sur le dessus d’un flacon alimentaire, soit l’ajout à de la nourriture pour mouches fondue, il a été constaté que cette dernière produit de meilleurs résultats en termes de variabilité réduite. Cependant, la différence est marginale et la première méthode est plus rapide. Il est recommandé aux expérimentateurs de comparer les deux méthodes et de choisir celle qui convient le mieux. Les mouches peuvent être autorisées à pondre des œufs sur des aliments contenant des médicaments, de sorte que la totalité du développement larvaire est exposée à des aliments creusés. Alternativement, les larves peuvent être placées sur des aliments contenant du médicament à n’importe quel stade souhaité pour identifier le moment critique de l’activité du médicament. Donner des médicaments aux femelles gravides est une méthode efficace pour exposer les embryons en développement aux médicaments²⁵.

Un autre test de saisie couramment utilisé est l’utilisation d’embryons de poisson-zèbre exposés au pentylènetétrazole proconvulsivant pour dépister les ASM³⁰. À notre avis, le test larvaire de la drosophile présente de nombreux avantages. Ceux-ci incluent (1) de nombreux composés sont difficiles à dissoudre dans l’eau de mer artificielle dans laquelle les poissons nagent ; (2) l’essai du poisson-zèbre repose sur la réduction de la longueur de nage, ce qui peut se produire soit à la suite d’une exposition à un ASM, soit, de manière contre-intuitive, à un composé proconvulsivant. En effet, l’augmentation de l’activité convulsive chez le poisson-zèbre entraîne également une réduction de la nage¹⁰. Ainsi, tout résultat positif d’un composé doit être suivi d’un dépistage secondaire, ce qui nécessite souvent la mesure de gènes neuronaux inductibles précoces tels que c-fos ; (3) Le poisson ne peut être utilisé sans permis d’animal que jusqu’au 5e jour après l’éclosion. Bien sûr, le poisson-zèbre a un avantage distinct sur les insectes en ce sens que son principal neurotransmetteur excitateur est le glutamate et non l’acétylcholine³¹. Une combinaison des deux essais, en commençant par la drosophile et suivie par le poisson-zèbre, pourrait fournir un dépistage très puissant avant que moins de composés touchés ne soient testés chez la souris.

Pour résumer, le test d’électrochocs larvaires de drosophile , associé à la haute conservation de la génétique et de la physiologie partagées entre les mouches et les mammifères, fournit un dépistage très efficace, rapide et peu coûteux pour identifier de nouvelles thérapies anticonvulsivantes. L’adoption accrue de cet insecte pour le dépistage des drogues répondra également au besoin urgent de réduire le nombre d’animaux d’ordre supérieur utilisés pour la recherche médicale.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nous remercions les nombreux membres du personnel du laboratoire Baines qui ont développé conjointement cette technique pendant de nombreuses années, et en particulier, Richard Marley, qui a déployé beaucoup d’efforts pour rendre cette technique robuste et fiable. Nous remercions Anna Munro d’avoir dessiné les larves, comme le montre la figure 2. Les travaux du laboratoire de Baines qui ont contribué à la mise au point de cette technique ont été généreusement soutenus par le BBSRC, le MRC et le Wellcome Trust. Ce travail est actuellement soutenu par un financement d’une bourse de chercheur du Wellcome Trust à R.A.B. (Subvention 217099/Z/19/Z). Le développement de cette technique a également bénéficié du Manchester Fly Facility, qui a été créé grâce à des fonds de l’Université et du Wellcome Trust (subvention 087742/Z/08/Z).