Method Article
Разработан протокол подготовки очищенных митохондрий из клеток микроглии, выделения митохондриальных белков для высвобождения N-гликанов и быстрого детектирования субклеточных митохондриальных гликанов с помощью лазерной десорбционной ионизации с помощью инфракрасной матрицы в сочетании с точной масс-спектрометрией масс-анализатора высокого разрешения.
Понимание закономерностей гликозилирования митохондриальных белков в микроглии имеет решающее значение для определения их роли в нейродегенеративных заболеваниях. В данной работе мы представляем новую и высокопроизводительную методологию гликомического анализа митохондриальных белков, выделенных из культивируемой микроглии. Этот метод включает в себя выделение митохондрий из культур микроглии, оценку качества образцов митохондрий с последующей оптимизированной экстракцией белка для максимального обнаружения гликана и масс-спектрометрию высокого разрешения (HRAM) с помощью лазерной десорбции электроспрея с помощью инфракрасной матрицы (IR-MALDESI) для получения подробных профилей митохондриального гликозилирования.
Этот протокол подчеркивает важность поддержания целостности митохондрий во время выделения и использует строгий контроль качества для обеспечения воспроизводимости, включая измерение чистоты митохондрий после экстракции. Этот подход позволяет всесторонне профилировать изменения гликозилирования в микроглиальных митохондриях в различных экспериментальных условиях in vitro, что дает представление о митохондриальных изменениях, связанных с нейродегенеративными заболеваниями. Этот подход может быть адаптирован к другим методам лечения in vitro , другим типам культивируемых клеток или первичным клеткам. С помощью этого стандартизированного подхода мы стремимся улучшить понимание микроглиальных митохондриальных гликанов, внося свой вклад в более широкую область нейродегенеративных исследований.
Микроглия является доминирующей резидентной клеткой врожденного иммунитета в головном мозге и составляет 10-15%клеток мозга взрослого человека1,2. Они используют свой рецепторный репертуар для динамического мониторинга микроокружения мозга и регуляции нормальной функции мозга для поддержания гомеостазамозга. Микроглия очень чувствительна к изменениям в микроокружении и претерпевает изменения морфологии клеток, иммунофенотипа и функции при патологических состояниях или различных стимуляциях. На состояния активации микроглии влияют потребности клеток в энергии, необходимые для их функционирования, такие как фагоцитоз, выработка цитокинов или восстановление тканей. Таким образом, клеточный энергетический метаболизм играет решающую роль в регулировании изменений функции микроглии4. Нарушение регуляции микроглии приводит к чрезмерному высвобождению провоспалительных цитокинов (например, IL-1β, TNF-α) и активных форм кислорода (АФК), предрасполагая мозг к нейровоспалению 5,6. Хроническая дисрегуляция микроглии и возникающая в результате нейровоспалительная среда закладывают основу для нейродегенерации7.
На мозг приходится всего 2% массы тела, но 20% от общего потребления энергии организмом. Митохондрии являются основным источником энергии в клетках мозга и выступают в качестве ключевых игроков в патогенезе как острых, так и хронических заболеваний мозга8. Предыдущие исследования установили сильную корреляцию между активацией микроглии и метаболической дисфункцией в возрасте9 лет и возрастными расстройствами, такими как болезнь Альцгеймера10,11, подчеркивая ключевую роль митохондрий в клеточном старении и нейродегенерации. Нарушение функции митохондрий приводит к снижению выработки энергии, повышенному окислительному стрессу и усилению нейровоспаления при старении и возрастных заболеваниях.
В то время как обширные исследования прояснили роль митохондрий в энергетическом обмене, старении и расстройствах мозга, роль общих посттрансляционных модификаций, таких как гликозилирование, в биологии и функции митохондрий остается недостаточно изученной. Гликозилирование, ферментативное добавление сахарных фрагментов, называемых гликанами, к белкам с помощью ферментов гликозилирования, является наиболее распространенной посттрансляционной модификацией в большинстве клеток мозга, включая микроглию. Активированные микроглии модулируют свою иммунную функцию под действием воспалительных стимулов, регулируя внутриклеточную или поверхностную экспрессию гликанов12. Про- и противовоспалительные реакции, проявляемые микроглией после стимуляции, также регулируются гликанами13. Митохондриальные белки также имеют эти модификации гликанов, которые регулируют их функцию и локализацию. Тем не менее, детальный анализ специфичных для клеток паттернов митохондриального гликозилирования в микроглии отсутствует из-за технических сложностей в исследовании субклеточного гликозилирования. Несмотря на хорошо описанную роль гликозилирования в модуляции фенотипа микроглии, роль гликанов в модуляции митохондриальной функции и, следовательно, клеточного иммунофенотипа в микроглии остается плохо изученной.
Ограниченные исследования, изучающие гликозилирование митохондриальных белков, были сосредоточены в основном на идентификации паттернов гликозилирования на основе лектина. Лектины представляют собой гликан-связывающие белки, связывающие биомолекулярные гликановые фрагменты14,15, которым не хватает специфичности и способности предоставлять подробную информацию о составе гликанов. Масс-спектрометрические методы обеспечивают детальную идентификацию составов гликанов для решения аналитических проблем, возникающих при лектиновом анализе. Один из таких методов, инфракрасная матричная лазерная десорбционная электрораспыляемая ионизация (IR-MALDESI), использует гибридную стратегию ионизации, используя лазер среднего инфракрасного диапазона для резонансного возбуждения воды, обнаруженной в биологических образцах16, для десорбции нейтральных веществ и воздействия на них ортогонального шлейфа электрораспыления с последующим анализом с использованием точного масс-спектрометра Orbitrap с высоким разрешением. Ранее было продемонстрировано применение IR-MALDESI для прямого анализа тканевых метаболитов17 с явными преимуществами экспресс-анализа18, метода мягкой ионизации и предсказуемости содержания сиаловых кислот в N-связанных гликанах на основе изотопных схем распределения хлорированных гликанов19. Тем не менее, адаптация этой платформы для прямого анализа субклеточных гликанов не была продемонстрирована.
В данной работе мы сообщаем о высокопроизводительном протоколе для выделения митохондрий из клеток микроглии, выделения митохондриальных N-гликанов, а также обнаружения и анализа митохондриальных N-гликанов с помощью масс-спектрометрии IR-MALDESI. Этот протокол будет иметь основополагающее значение для раскрытия новых идей о роли гликозилирования в функции митохондрий, потенциально выявляя новые терапевтические мишени для нейровоспалительных и нейродегенеративных заболеваний.
1. Культура микроглиальной клеточной линии BV2
2. Выделение митохондрий из клеток микроглии
ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте быстро, держа все на льду на протяжении всей процедуры. Набор для митохондриальной изоляции, используемый для митохондриальной изоляции, состоит из трех компонентов: реагенты А (буфер для лизиса клеток), реагент В (стабилизирующий буфер) и реагент С (митохондриальный буфер для промывки). Добавляйте ингибиторы протеазы в реагент А и реагент С непосредственно перед применением.
3. Оценка белка с помощью анализа microBCA
ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка белка для этого протокола может быть выполнена с использованием различных реагентов и анализов. Количественное определение цитозольных или митохондриальных белков может быть выполнено путем нормализации по отношению к общей концентрации белка, используемой в анализе.
4. Контроль качества митохондриального препарата (вестерн-блоттинг)
5. Выделение митохондриального белка для экстракции N-гликана из микроглии
6. Митохондриальный N-гликановый препарат для IR-MALDESI
7. Детектирование высвобождаемых гликанов с помощью масс-спектрометрии IR-MALDESI
8. Анализ данных митохондриального N-гликана
На рисунке 1 представлена схематическая схема этапов выделения митохондрий из линии микроглиальных клеток BV2 для масс-спектрометрического анализа гликанов. Воспроизводимость выделения митохондриальных белков между различными митохондриальными препаратами из одинаковой начальной плотности клеток микроглии представлена на рисунке 2, где не показано существенной разницы между концентрацией митохондриального белка, оцененной с помощью анализа микро БЦА.
На рисунке 3 представлена чистота митохондриальных изоляций с использованием вестерн-блоттинга ЦОГ IV и GAPDH. Здесь мы видим экспрессию митохондриального белка COX IV в митохондриальной фракции, выделенной на заключительном этапе выделения на основе реагентов, используемых в протоколе. Иммуноблоттинги показывают заметную полосу ЦОГ IV в изолированной митохондриальной фракции, в то время как GAPDH обнаруживается только в цитоплазматической фракции при той же экспозиции. Более длительное время экспозиции может привести к обнаружению слабой полосы GAPDH. Экспрессия немитохондриального маркера GAPDH очевидна во всей клеточном лизате после выделения митохондрий, без полос CoxIV, что указывает на полную изоляцию митохондриальной фракции и минимальную немитохондриальную контаминацию. Экспрессия ЦОГ IV в митохондриальных фракциях постоянна между различными препаратами с одинаковой плотностью исходных клеток 2 × 107 клеток.
Репрезентативные масс-спектры высвобожденных N-гликанов, обнаруженных с помощью IR-MALDESI на рисунке 4, показывают присутствие нескольких фосфорилированных, сульфатированных и сиатилированных заряженных N-гликанов, высвобождаемых из экстракта митохондриального белка при обработке PNGase. В таблице 2 представлены все гликановые композиции, которые были идентифицированы во всех спектрах, но не были зарегистрированы в GlyConnect. Значения хи-квадрат, проверяющие хорошую посадку, подтверждают обнаружение N-связанных гликанов с одним и двумя аддуктами хлора, подтверждая обнаружение этих гликанов с помощью IR-MALDESI на рисунке 5.
Рисунок 1: Схема протокола. Схематическая схема выделения митохондрий, контроля качества, экстракции белка, высвобождения N-гликанов и оценки с помощью масс-спектрометрии IR-MALDESI HRAM из линии микроглиальных клеток BV2 для высокопроизводительного обнаружения митохондриальных N-гликанов. Аббревиатура: IR-MALDESI HRAM = инфракрасный матричный лазерный десорбционный электроспрей ионизационный высокоразрешающий точный масс-анализатор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Выделение митохондриального белка из клеток BV2. (A) Стандартная кривая для микроанализа BCA с использованием различных концентраций BSA. (B) Воспроизводимость выделения митохондриального белка, представленная постоянным содержанием белка из 2 × 107 клеток в шести независимых митохондриальных препаратах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3: Чистота митохондриального препарата. Репрезентативный вестерн-блоттинг для цитоплазматической фракции, а также выделенные митохондрии из микроглиальных клеток BV2. На рисунке представлен иммуноблоттинг цитоплазматической фракции и выделенных митохондрий антителом к ЦОГ IV (митохондриальный маркер) и антителом к GAPDH (цитоплазматический контроль). Отсутствие полос GAPDH в изолированных митохондриях свидетельствует о минимальной перекрестной контаминации и чистоте митохондриального препарата для последующего анализа N-гликанов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4: Определение идентификационного состава митохондриального N-гликана с помощью масс-спектрометрии IR-MALDESI HRAM. Масс-спектры гликана в диапазоне 1700-2000 м/з показывают значительное количество многозарядных пиков с аннотированными структурами, определенными с помощью Гликомода. Аббревиатура: IR-MALDESI HRAM = инфракрасный матричный лазерный десорбционный электроспрей ионизационный высокоразрешающий точный масс-анализатор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5: Верификация обнаруженных митохондриальных N-гликанов. Репрезентативные изотопные распределения для четырех (A-D) митохондриальных N-связанных гликанов, показывающие наложение наблюдаемого распределения с теоретическими распределениями хлора и депротонированных аддуктов. Значения хи-квадрат на наложенных спектрах представляют собой хорошее соответствие и подтверждают обнаружение N-связанных гликанов с одним и двумя аддуктами хлора. Это является еще одним подтверждением обнаружения этих гликановых композиций с помощью IR-MALDESI. Аббревиатура: IR-MALDESI = инфракрасная матрица с лазерной десорбцией электроспрей ионизация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Таблица 1: Рецепты растворов и буферов, используемые в протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 2: Mультипически заряженные депротонированные N-связанные гликаны, обнаруженные в митохондриях с высокой точностью измерения массы в гликомоде. Сокращенное обозначение гликаном: H = гексоза; N = N-ацетилглюкозамин; F = фукоза; S = N-ацетилнейраминовая кислота; Phos = фосфат; Сульфат = модификация сульфата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Микроглия является резидентными иммунными клетками головного мозга, а модификации гликана модулируют иммунофенотип и функцию микроглии. Эти иммунные функции требуют значительного количества клеточной энергии, которая в основном поставляется митохондриями. Примечательно, что митохондриальные белки также представляют модификации гликанов, которые остаются в значительной степени малоизученными из-за технологических сложностей в исследовании субклеточного гликозилирования. Большинство исследований, изучающих митохондриальное гликозилирование, основаны на лектиновой идентификации гликановых паттернов22, хотя эти подходы ограничены низкой специфичностью связывания лектинов. Существенными достижениями технического подхода, представленного в этом исследовании, являются: i) воспроизводимое выделение митохондриальных N-гликанов из клеток микроглии и ii) обнаружение и идентификация митохондриальных N-гликанов с помощью масс-спектрометрии IR-MALDESI HRAM. Описанный здесь рабочий процесс является первым сообщением об обнаружении N-гликанов, высвобождаемых из митохондриальных гликопротеинов, экспрессируемых на физиологических уровнях в клетках микроглии.
В настоящем протоколе митохондриальная изоляция максимизируется за счет использования метода выделения на основе реагентов. Это можно сочетать с методом гомогенизации Dounce для улучшения митохондриального выхода. Недостатком использования гомогенизатора по сравнению с изоляцией на основе реагентов является разброс силы и скорости движения пестика между операторами, что приводит к увеличению экспериментальной вариативности и снижению воспроизводимости. Предыдущие исследования23,24 указывали на использование этого метода и отсутствие ядерных (ламин, гистон H3) и ER-маркеров (кальнексин, Erp57) в митохондриальной фракции, что указывает на чистоту митохондриальной фракции. Потенциальным ограничением протокола является требование 20 миллионов клеток в качестве исходного материала для выделения митохондрий. Тем не менее, высокая концентрация митохондриальных белков, наблюдаемая в нашем исследовании, позволяет в десять раз уменьшить исходное количество микроглиальных клеток для выделения митохондрий на основе оптимизации, выполненной в предыдущих исследованиях25,26 (25-250 мкг белков) без потери N-гликановых сигналов. Кроме того, объединение биологических образцов для получения большего количества клеток для выделения митохондрий может быть выполнено в случае ограниченной масштабируемости протокола для снижения количества клеток из первичных источников, таких как ткани, для эффективного обнаружения гликанов. Кроме того, этап высвобождения гликана имеет решающее значение в этом протоколе. N-гликозидаза F (PNGase F) используется для высвобождения полных и интактных N-связанных гликанов путем гидролиза амидной связи между самым внутренним N-ацетилглюкозамином (GlcNAc) и остатком аспарагина27. Для анализа N-гликанов крайне важно оптимизировать активность PNGазы F для достижения полного дегликозилирования митохондриальных белков. Денатурация белков с использованием растворителя и избытка фермента помогает обеспечить эффективное и полное расщепление и высвобождение N-гликанов из митохондриальных белков. Время разложения 18-20 ч является оптимальным для высвобождения N-гликана путем завершения реакции PNGase F26.
Потенциальным ограничением этого протокола является недостаточное обогащение митохондриального экстракта гликопротеинами в этом методе. Несмотря на то, что гликопротеины с низким содержанием могут быть не обнаружены при анализе, этот метод сводит к минимуму погрешность и систематическую ошибку, вызванные очисткой сродства к лектину или химическим обогащением. В то время как IR-MALDESI обеспечивает высокую степень достоверности идентификации состава идентифицированных гликанов, точная информация о связях между остатками гликанов требует дальнейших исследований с использованием тандемной масс-спектрометрии гликанов, аддуцированных литием, для усиления перекрестных кольцевых расщеплений28 или расщепления экзогликозидазы. В качестве альтернативы можно использовать ЖХ-МС/МС в дополнение или в качестве альтернативы подходу IR-MALDESI, который может обеспечить более глубокое покрытие гликанами с большим количеством структурных деталей. Тем не менее, предыдущие исследования показали корреляцию между средним содержанием ионов в IR-MALDESI для метаболитов и абсолютными величинами, определенными с помощью LC-MS/MS29, что создает основу для прямого количественного определения метаболитов с использованием IR-MALDESI. Высокая пропускная способность IR-MALDESI с возможностью проведения анализа MS2 для обеспечения структурного подтверждения с высокой степенью достоверности играет важную роль в быстром скрининге доклинических и клинических образцов на потенциальные биомаркеры гликана и диагностику заболевания. Кроме того, следует отметить, что, хотя центрифугирование постядерной надосадочной жидкости при 3000 × г вместо 12 000 × г минимизирует пероксисомальные и лизосомальные загрязнители, следы этих белков все же могут присутствовать в митохондриальном препарате.
В заключение, в этом исследовании представлен простой, высокопроизводительный метод с минимальной подготовкой образцов для анализа митохондриального гликома в клетках микроглии и большим потенциалом для применения в идентификации новых терапевтических мишеней на основе гликана для лечения нейродегенеративных заболеваний. Этот протокол представляет собой всестороннюю оценку и стандартизацию аналитических методов выделения митохондрий из микроглии и последующего анализа митохондриальной железы для масштабирования крупномасштабных доклинических и клинических исследований. Этот протокол имеет ряд преимуществ для выделения и обнаружения N-гликанов: i) время выделения митохондрий для протокола на основе реагентов низкое (≤40 мин); ii) выход белков для высвобождения гликана высок; iii) одни и те же митохондриальные образцы, подготовленные для анализа N-гликанов, могут быть использованы для других молекулярно-биологических исследований, таких как протеомный анализ, анализ лектинов и анализ митохондриального потока; и iv) масс-спектрометрия IR-MALDESI HRAM позволяет быстро и лучше обнаруживать N-гликаны благодаря стратегии гибридной и мягкой ионизации28 без необходимости химической дериватизации заряженных гликанов, таких как сиалогликаны и сульфогликаны30.
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.
Авторы хотели бы поблагодарить Сета Айзенберга, аспиранта лаборатории Маддимана в NCSU, за его помощь в видеозаписи масс-спектрометрического протокола. Это исследование было частично поддержано Программой стипендиатов Школы инженерных инноваций при Университете Алабамы в Бирмингеме, AG068309 до D.J.T. и R01GM087964-12 до D.C.M. Схемы в этой рукописи были нарисованы с помощью BioRender.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Amersham 600 imager | Cytvia | 29194217 | Gel and membrane imager |
Countess 3 automated cell counter | Fisher Scientific | X003SZ1LY9 | |
Dry Bath Stdrd 4 blck 100-120V | Thermofisher scientific | 88870003 | |
i-Blot2 Gel Transfer Device | Invitrogen | IB21001 | Western blot transfer system |
Inverted microscope | Cell Treat | 04355223EA | |
Microplate reader | 82050-760 | ||
Mini gel tank | Invitrogen | A25977 | |
Open Air Rocker | Fisher Brand | 88861025 | |
Pipet boy | BioTek | 229310 | |
Vortex mixer | Integra- VWR | ||
Mitochondria isolation reagents | |||
Mitochondrial Isolation kit | Thermofisher scientific | 89874 | |
Phosphotase Inhibitor | Thermofisher scientific | 1861274 | |
Protease Inhibitor | Thermofisher scientific | 1861281 | |
N-glycan isolation and IR-MALDESI reagents | |||
Acetic acid | Fisher Scientific | A11350 | 50% in ESI solvent |
Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34851-4L | 1 mM in ESI solvent |
Ammonium bicarbonate | Fisher Scientific | A643500 | 100 mM |
Calibration Solution | Thermofisher Scientific | A39239 | Pierce FlexMix |
Dithiothreitol | Sigma Aldrich | AC426380100 | 1 M |
Iodoacetamide | Sigma Aldrich | A322-10VL | |
LC/MS grade water | Thermofisher Scientific | 047146.M6 | |
PNGase F | Bulldog Bio | NZPP010 | 75000 U/mL, enzyme for N-glycan release |
N-glycan isolation and IR-MALDESI consumables | |||
Amicon centrifugal filters | Fisher Scientific | UFC501024 | 10 kDa MWCO |
Mass spectrometer | Orbitrap Exploris 240 | ||
Mid-IR Laser | JGM Associates, Burlington, MA, USA | ||
Teflon microwell slide | Prosolia, Indianapolis, IN, USA | ||
N-glycan analysis softwares | |||
GlycoMod | Expasy | https://web.expasy.org/glycomod/ | |
GlyConnect | Expasy | https://glyconnect.expasy.org/ | |
Protein isolation and western blot consumables | |||
Basix gel loading tips ( 10 µL) | Basix | 13-611-102 | |
Basix gel loading tips ( 200 µL) | Basix | 13-611-116 | |
Cell scrapper | VWR labs | 14-388-100 | |
i-Blot NC regular stacks | Invitrogen | IB23001 | |
i-Blot2 PVDF Regular Stacks | Invitrogen | IB24001 | |
10 µL micropipette | Fisher Scientific | FBE00010 | |
20 µL micropipette | Invitrogen | FBE00020 | |
200 µL micropipette | Fisher Brand | FBE00200 | |
1000 µL micropipette | Fisher brand | FBE01000 | |
10 µL pipet tips | VWR labs | 76322-528 | |
20 µL pipet tips | VWR labs | 76322-134 | |
200 µL pipet tips | VWR labs | 76322-150 | |
1000 µL pipet tips | VWR labs | 76322-154 | |
Well plate | Fisher brand | 14-388-100 | |
Protein isolation and western blot reagents | |||
Actin antibody ( Host : Rabbit ) | Cell Signaling Technologies | 8457T | |
Anti-Rabbit IgG HRP Linked | Cell Signaling Technologies | 7074S | |
Bolt 4-12% Bis-Tris Plus | Invitrogen | NW04120BOX | |
Bovine Serum Albumin | Fisher bioreagents | BP9700-100 | |
COXIV antibody ( Host : Rabbit) | Cell Signaling Technologies | 4844S | |
GAPDH antibody ( Host : Rabbit) | Cell Signaling Technologies | 2118S | |
MicroBCA protein assay Kit | Thermofisher scientific | 23235 | |
Nupage MOPS SDS Runing Buffer [20x] | Thermofisher scientific | NP0001 | |
PAGE Ruler prestained protein ladder | Thermofisher scientific | 815-968-0747 | Dilution= Use 7 µL to load onto first well |
Phosphate buffered saline | Aniara Diagnostics | A12-9423-5 | Prepare 1x PBS from 10x powder |
Pierce ECL Western Blotting Substrate | Thermofisher scientific | 32106 | Chemiluminescent substrate kit |
RIPA Buffer | Thermofisher scientific | 89901 | |
Sample Buffer | Novex | B0007 | The bolt LDS sample buffer is prepared in 3:1 ratio of sample to sample buffer |
Tween-20 | MP Biomedicals | TWEEN201 | |
Tissue culture consumables | |||
Countess Slides | Avantor | 229411 | |
Eppendorf tubes | Cell Treat | 414004-265612-5884 | |
2 mL aspirating pipet | Vista lab | 5090-0010E | |
5 mL serological pipet | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
10 mL serological pipet | Basix | 13-678-11E | |
25 mL serological pipet | Vista lab | FB012937 | |
50 mL serological pipet | Vista lab | 14955233 | |
15 mL Conical tube | Avantor | 229225A | |
50 mL conical tube | Cell treat | 4190-0050 | |
T-75 cm2 Tissue culture flask | Fisher Scientific | FB012937 | |
T-180 cm2 Tissue culture flask | Fisher Scientific | FB012939 | |
Tissue culture reagents | |||
BV2 microglial cell line | Creative Bioarray | CSC-I2227Z | Immortalized Mouse Microglia (BV2) derived from C57/BL6 neonatal microglia |
Cell dissociation enzymes | Thermofisher scientific | 12563029 | TrypLE |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Low Glucose Media | Gibco | 10567014 | |
Fetal Bovine Serum | Cytiva | SH30071.03HI | |
Minimum Essential Medium (MEM) Non-essential Amino Acids | Gibco | 11140050 | |
Penicillium Streptomycin | Cytivia | SV30010 | |
Phosphate buffer saline | Corning | 21-040-CV | |
Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены